【摘要】：脂聯(lián)素是哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的一種脂肪細胞因子。除了調(diào)節(jié)機體能量平衡外,脂聯(lián)素還具有增強胰島素敏感性,抵抗動脈粥樣硬化和抵抗炎癥的作用。脂聯(lián)素過表達可降低血糖和改善胰島素抵抗。相反,脂聯(lián)素基因敲除可導(dǎo)致胰島素抵抗和葡萄糖不耐受。肥胖個體血液中脂聯(lián)素水平呈顯著下降。脂聯(lián)素在循環(huán)系統(tǒng)中主要以三種復(fù)合體的形式存在:三聚體(LMW),六聚體(MMW),和含有18-36個脂聯(lián)素單體的高聚體(HMW)形式,HMW在總脂聯(lián)素中的含量決定胰島素的增敏能力。脂聯(lián)素的多聚化依賴于分子間二硫鍵的形成,而蛋白質(zhì)二硫鍵的形成發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶ERO1-Lα,Dsb A-L和ERp44在脂聯(lián)素多聚體尤其是高聚體的組裝和分泌過程中發(fā)揮重要的作用。作為一種內(nèi)分泌器官,脂肪組織可分泌大量的細胞因子,如TNF-α,leptin,IL-6,和visfatin等。肥胖個體中巨噬細胞向脂肪組織的浸潤可促進脂肪組織炎癥環(huán)境的形成。TNF-α主要由成熟的脂肪細胞和巨噬細胞分泌,在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用,是炎癥導(dǎo)致的胰島素抵抗過程中的一個重要的細胞因子。臨床研究證實,盡管脂聯(lián)素和TNF-α作為一種典型的脂肪組織分泌因子,但在肥胖和糖尿病患者的循環(huán)系統(tǒng)中,兩者的水平則呈顯著負相關(guān)。這是否因為TNF-α通過旁分泌或自分泌的方式直接調(diào)控脂聯(lián)素的多聚化和分泌,已成為該領(lǐng)域關(guān)注的焦點。本文通過離體細胞、高脂飲食和重組TNF-α處理的活體模型,系統(tǒng)的研究了TNF-α對脂聯(lián)素多聚化和分泌調(diào)控的分子機制,旨在回答脂聯(lián)素和TNF-α同屬脂肪組織分泌因子,但在肥胖患者循環(huán)系統(tǒng)中為何呈現(xiàn)顯著的消漲關(guān)系。研究結(jié)果如下:1.通過高脂飲食和腹腔注射TNF-α的方法建立了胰島素抵抗表型的小鼠模型,通過對小鼠模型各生理指標的檢測和比較發(fā)現(xiàn):高脂飼喂和TNF-α注射小鼠血糖和血漿胰島素含量均顯著升高;胰島素抵抗指數(shù)分析表明,兩組小鼠都表現(xiàn)出明顯的胰島素抵抗;與對照組相比,高脂飲食和腹腔注射TNF-α小鼠循環(huán)系統(tǒng)中脂聯(lián)素的分泌量顯著下降,HMW/總脂聯(lián)素的比值也顯著下降。2.TNF-α處理分化的3T3-L1脂肪細胞發(fā)現(xiàn),脂聯(lián)素分泌顯著下降,HMW/總脂聯(lián)素的比值也顯著下降;Real-time和Western blot分析表明,TNF-α處理顯著的抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶ERO1-Lα和Dsb A-L的表達。3.PPARγ激動劑、抑制劑處理及PPARγ敲減實驗證實,PPARγ可促進ERO1-Lα和Dsb A-L的轉(zhuǎn)錄。在克隆ERO1-Lα和Dsb A-L的啟動子序列的基礎(chǔ)上,生物信息預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果表明,PPARγ可增強ERO1-Lα和Dsb A-L的啟動子活性;染色質(zhì)免疫共沉淀實驗證實,PPARγ可特異地與ERO1-Lα和Dsb A-L啟動子區(qū)-1685/-1533bp和-939/-815bp處的PPRE元件結(jié)合,調(diào)控ERO1-Lα和Dsb A-L基因的表達,TNF-α處理顯著抑制PPARγ與相應(yīng)PPRE元件結(jié)合。4.TNF-α可抑制ERp44的轉(zhuǎn)錄,超表達PPARγ不能挽救這種抑制效應(yīng);免疫共沉淀實驗表明,TNF-α處理能增強ERp44與脂聯(lián)素分子之間的相互作用。上述結(jié)果證明,TNF-α抑制轉(zhuǎn)錄因子PPARγ的表達,并通過啟動子抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ERO1-Lα和Dsb A-L的表達,進而降低脂聯(lián)素的多聚化水平,抑制脂聯(lián)素的分泌,并通過ERp44對脂聯(lián)素分子的滯留,從而導(dǎo)致肥胖個體循環(huán)系統(tǒng)中脂聯(lián)素含量及多聚體形成的下調(diào)。
[Abstract]:Adiponectin is one of the most abundant adipocytokines in the circulatory system of mammals. In addition to regulating the body's energy balance, adiponectin also enhances insulin sensitivity, resists atherosclerosis and resists inflammation. Overexpression of adiponectin reduces blood sugar and improves insulin resistance. Conversely, adiponectin gene knockout can improve insulin resistance. Adiponectin is present in the circulatory system in the form of three major complexes: trimer (LMW), hexamer (MMW), and high polymer (HMW) containing 18-36 adiponectin monomers. The amount of HMW in total adiponectin determines the increase in insulin. Polymerization of adiponectin depends on the formation of intermolecular disulfide bonds. The formation of protein disulfide bonds occurs in the endoplasmic reticulum. The endoplasmic reticulum molecular chaperones ERO1-Lalpha, Dsb A-L and ERp44 play an important role in the assembly and secretion of adiponectin polymers, especially polymers. As an endocrine organ, adipose tissue is separable. The infiltration of macrophages into adipose tissue can promote the formation of inflammatory environment in adipose tissue. TNF-alpha is mainly secreted by mature adipocytes and macrophages, which play an important role in glucose and lipid metabolism and is one of the processes of insulin resistance induced by inflammation. Clinical studies have shown that although adiponectin and TNF-alpha are typical adipose tissue secreting factors, their levels are negatively correlated in the circulatory system of obese and diabetic patients. Is this because TNF-alpha directly regulates adiponectin polymerization and secretion by paracrine or autocrine means? In this paper, we systematically studied the molecular mechanism of TNF-alpha on adiponectin accumulation and secretion through in vitro cell, high-fat diet and recombinant TNF-alpha treatment in vivo. The aim is to answer why adiponectin and TNF-alpha are both adipose tissue secretory factors, but they are significant in the circulatory system of obese patients. The results are as follows: 1. Insulin resistance phenotype mice were established by high-fat diet and intraperitoneal injection of TNF-alpha. By testing and comparing the physiological indexes of the mice model, it was found that the blood glucose and plasma insulin content of the mice fed with high-fat diet and injected with TNF-alpha increased significantly. Compared with the control group, the secretion of adiponectin and the ratio of HMW to total adiponectin in the circulatory system of high fat diet and intraperitoneal injection of TNF-alpha decreased significantly. 2. TNF-alpha treated differentiated 3T3-L1 adipocytes showed a significant decrease in adiponectin secretion and HMW/total adiponectin ratio. Real-time and Western blot analysis showed that TNF-a treatment significantly inhibited the expression of ERO1-Lalpha and Dsb A-L. 3. PPAR gamma agonist, inhibitor treatment and PPAR gamma knockdown assay confirmed that PPAR gamma could promote the transcription of ERO1-Lalpha and Dsb A-L. Bioinformatics prediction and double luciferase reporter gene assay showed that PPAR gamma could enhance the promoter activity of ERO1-Lalpha and Dsb A-L. Chromatin immunoprecipitation assay confirmed that PPAR gamma could specifically bind to the PPRE elements in the promoter regions of ERO1-Lalpha and Dsb A-L, and regulate the expression of ERO1-Lalpha and Dsb A-L genes. TNF-alpha treatment significantly inhibited the binding of PPAR-gamma to the corresponding PPRE elements. 4. TNF-alpha could inhibit the transcription of ERP-44, but the over-expression of PPAR-gamma could not rescue the inhibitory effect. Immunocoprecipitation assay showed that TNF-alpha treatment could enhance the interaction between ERP-44 and adiponectin molecules. These results demonstrated that TNF-alpha inhibited the expression of PPAR-gamma and initiated it. Motors inhibit the expression of ERO1-Lalpha and Dsb A-L in the endoplasmic reticulum, thereby reducing the level of adiponectin polymerization and inhibiting the secretion of adiponectin. The retention of adiponectin molecules through ERp44 results in the down-regulation of adiponectin content and the formation of polymers in the circulatory system of obese individuals.
【學位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78;R363

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本文編號：2240125