【摘要】：第一章微小RNA-132通過抑制Nurrl促進卵巢顆粒細胞雌激素的合成目的：研究卵巢顆粒細胞中卵泡刺激素(FSH)通路對微小RNA-132 (miR-132)的調(diào)控以及miR-132影響顆粒細胞雌激素合成的分子機制。方法：體外分離培養(yǎng)21天ICR小鼠的原代卵巢顆粒細胞(mGC),經(jīng)8-Br-cAMP處理24 h后檢測mGC中miR-132的表達變化。mGC分別轉(zhuǎn)染miR-132模擬物(mimics)、Nurrl小干擾RNA、Flag-Nurrl質(zhì)�；�?qū)幮詫φ?8 h后,免疫化學發(fā)光法檢測細胞培養(yǎng)上清雌二醇(E2)和孕酮的濃度,real time PCR檢測Cyp19a1、Cyp11a1和Nurrl的mRNA水平改變；Western blot檢測miR-132對Nurrl蛋白表達的影響。構(gòu)建含有Nurrl基因3’不翻譯端(3'-UTR)序列的熒光素酶報告基因質(zhì)粒,驗證miR-132對Nurrl基因表達的轉(zhuǎn)錄后抑制作用。結(jié)果：體外培養(yǎng)的mGC經(jīng)8-Br-cAMP處理24 h后,miR-132的表達持續(xù)升高,并于12h達到峰值(4.8倍,P0.05)。高表達miR-132的mGC E2分泌水平升高70%以上(P0.01),而孕酮分泌無明顯改變。Real time PCR結(jié)果顯示miR-132促進雌激素合成限速酶-芳香化酶基因Cypl9al的表達(2.8倍,P0.01),而孕激素合成關鍵酶基因Cypllal無明顯改變。mGC高表達miR-132后Nurr1蛋白水平明顯抑制,但Nurrl mRNA的水平無顯著改變；miR-132可顯著抑制pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-WT質(zhì)粒熒光素酶活性(P0.01),而對其靶向序列突變后的pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-MU質(zhì)粒無顯著影響。以上研究表明miR-132可通過轉(zhuǎn)錄后抑制孤兒核受體Nurr1的表達,減弱Nurr1對Cypl9al基因PII啟動子的抑制。mGC轉(zhuǎn)染siNurr1干擾內(nèi)源性Nurr1表達后,miR-132促進E2合成的作用被明顯削弱；mGC中高表達Flag-Nurr1后,外源性Nurr1可顯著抵消miR-132促進E2合成的效應。結(jié)論：miR-132通過靶向Nurr1 mRNA的3'-UTR,轉(zhuǎn)錄后抑制Nurr1的蛋白表達,間接上調(diào)Cyp19a1,促進卵巢顆粒細胞的E2合成。第二章微小RNA-132靶向抑制Foxal誘導卵巢顆粒細胞凋亡目的： 研究miR-132通過直接靶向抑制小鼠卵巢中Foxal基因的蛋白表達,進而影響雌激素受體(ER)通路,促進顆粒細胞凋亡的分子機制。方法：在原代培養(yǎng)的mGC瞬時轉(zhuǎn)染miR-132 mimics高表達外源性miR-132后,分別通過流式細胞術Annexin V和Cell Death Detection ELISA檢測顆粒細胞凋亡程度。Western blot檢測miR-132高表達對mGC中ERa和ERβ蛋白表達的影響。免疫組織化學檢測Foxal在小鼠卵巢卵泡中的表達和分布,以及檢測PMSG處理后卵巢Foxal表達的變化。熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚖estern blot驗證Foxal為miR-132直接的靶基因。利用Foxal特異性的小干擾RNA (siRNA)序列基因沉默內(nèi)源性Foxal,研究其通過下調(diào)ERa參與mGC凋亡的機制。此外通過細胞免疫熒光實驗觀察miR-132對ERa蛋白核定位的影響。結(jié)果：流式細胞術Annexin V和Cell Death Detection ELISA檢測結(jié)果均顯示轉(zhuǎn)染miR-132 mimics后促進mGC凋亡(P0.05),并呈現(xiàn)劑量相關性。mGC中高表達miR-132后可以明顯下調(diào)ERa蛋白的表達,而對ERβ的蛋白則無明顯作用。小鼠卵巢中Foxal蛋白主要表達于各級卵泡的顆粒細胞中；出生后21天小鼠給予PMSG (5 IU/只)刺激后,卵巢生長卵泡的顆粒細胞中Foxal的免疫組織化學信號明顯減弱。與對照組相比,miR-132可顯著抑制pmirGLO-luc-Foxa1 3'-UTR熒光素酶活性達45%(P0.05),并且抑制Foxal蛋白表達的表達水平,證明miR-132直接轉(zhuǎn)錄后抑制Foxal基因的表達。特異性siFoxal沉默內(nèi)源性Foxal基因表達后,Western blot結(jié)果顯示凋亡細胞中ERa表達相應減少,mGC凋亡亦明顯增加(P0.001)。細胞免疫熒光實驗顯示外源性高表達miR-132還可以促進ERa蛋白由細胞核內(nèi)向mGC細胞漿中分散。結(jié)論：miR-132通過直接靶向抑制mGC中Foxa1的基因表達,下調(diào)ERa水平,并促進ERa核輸出,誘導mGC凋亡。
[Abstract]:Chapter 1 MicroRNA-132 promotes estrogen synthesis in ovarian granulosa cells by inhibiting Nurrl: To investigate the regulation of follicle stimulating hormone (FSH) pathway on microRNA-132 (microRNA-132) in ovarian granulosa cells and the molecular mechanism of microRNA-132 affecting estrogen synthesis in granulosa cells. Methods: Primary ovaries of 21-day ICR mice were isolated and cultured in vitro. Mimics, Nurrl small interfering RNA, Flag-Nurrl plasmid or corresponding negative control were transfected with mGC for 48 hours. Immunochemiluminescence assay was used to detect the concentration of estradiol (E2) and progesterone in the supernatant of cell culture. Real-time PCR was used to detect Cyp19a1, Cyp11a1 and Nurrl. Western blot was used to detect the effect of microRNAs-132 on the expression of Nurrl protein. Luciferase reporter gene plasmid containing 3'-UTR sequence of Nurrl gene was constructed to verify the inhibitory effect of microRNAs-132 on the transcriptional expression of Nurrl gene. The secretion level of mGC E2 with high expression of miR-132 increased by more than 70% (P 0.01), while progesterone secretion did not change significantly. Real-time PCR results showed that microwave-132 promoted the expression of estrogen synthesis rate-limiting enzyme-aromatase gene Cypl9al (2.8 times, P 0.01). Mi-132 significantly inhibited the activity of luciferase in pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-WT plasmid (P 0.01), but had no significant effect on the mutant pmirGLO-luc-Nurrl 3'-UTR-MU plasmid. After transfection of siNurr1 into mGC, the effect of microRNAs-132 on E2 synthesis was significantly weakened. After high expression of Flag-Nurr1 in mGC, exogenous Nurr1 significantly counteracted the effect of microRNAs-132 on E2 synthesis. Nurr1 mRNA 3'-UTR, after transcription, inhibits the expression of Nurr1 protein, indirectly up-regulates Cyp19a1 and promotes E2 synthesis in ovarian granulosa cells. Chapter 2 MicroRNA-132 targeting inhibits Foxal-induced apoptosis of ovarian granulosa cells. Objective: To investigate the effect of microRNA-132 on estrogen receptor (E) by directly targeting the expression of Foxal gene in mouse ovary. Methods: After primary cultured mGC transfected with high expression of exogenous miR-132 mimics, the apoptosis of granulosa cells was detected by flow cytometry Annexin V and Cell Death Detection ELISA respectively. Western blot was used to detect the expression of ERa and ER beta proteins in mGC. Effects. Immunohistochemistry was used to detect Foxal expression and distribution in mouse ovarian follicles and the changes of Foxal expression after PMSG treatment. Luciferase reporter gene assay and Western blot confirmed that Foxal was a direct target gene for microarray-132. Foxal-specific small interfering RNA (siRNA) sequence gene was used to silence endogenous Foxal. Results: The results of flow cytometry, Annexin V and Cell Death Detection ELISA showed that the transfection of Mi-132 mimics promoted the apoptosis of mGC (P 0.05), and showed a dose-dependent relationship. Mi-132 was overexpressed in mGC. Foxal protein was mainly expressed in granulosa cells of all levels of follicles. Immunohistochemical signals of Foxal in granulosa cells of ovarian follicles of 21 days postnatal mice stimulated by PMSG (5 IU / mouse) were significantly weakened. Mi-132 significantly inhibited the activity of pmirGLO-luc-Foxa1 3'-UTR luciferase up to 45% (P Cell immunofluorescence assay showed that exogenous high expression of miR-132 could also promote the dispersion of ERa protein from the nucleus to the cytoplasm of mGC. Conclusion: Mi-132 could inhibit the expression of Foxa1 gene in mGC by direct targeting, down-regulate the level of ERa, and promote the output of ERa nucleus, and induce apoptosis of mGC.
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321

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本文編號：2221702