【摘要】：目的構(gòu)建帶FLAG標(biāo)簽的半胱氨酸和甘氨酸富集蛋白1(CRP1)的真核表達(dá)載體,明確該融合蛋白在人胚腎293T細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞和乳腺癌ZR75-1細(xì)胞中的表達(dá)及定位情況。方法采用PCR技術(shù)從乳腺cDNA文庫(kù)中擴(kuò)增出人CRP1基因,并將其插入到pCMV-Tag2B表達(dá)載體中;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌ZR75-1細(xì)胞,Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)情況;熒光顯微鏡觀察pCMV-FLAG-CRP1在人胚腎293T細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌ZR75-1細(xì)胞中的定位。結(jié)果雙酶切和測(cè)序鑒定表明,pCMV-FLAG-CRP1真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;Western blot法檢測(cè)pCMV-FLAG-CRP1轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌ZR75-1細(xì)胞后成功表達(dá);熒光顯微鏡下觀察,在293T、HepG2、ZR75-1細(xì)胞中,CRP1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布,且胞質(zhì)信號(hào)強(qiáng)于胞核。結(jié)論成功構(gòu)建pCMV-FLAG-CRP1真核表達(dá)載體,CRP1可在不同細(xì)胞中的胞質(zhì)和胞核表達(dá)。
[Abstract]:Objective to construct the eukaryotic expression vector of cysteine and glycine enriched protein 1 (CRP1) labeled with FLAG, and to determine the expression and localization of the fusion protein in 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer. Methods Human CRP1 gene was amplified by PCR from mammary gland cDNA library and inserted into pCMV-Tag2B expression vector. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer. The localization of pCMV-FLAG-CRP1 in 293T cells of human embryonic kidney, HepG2 cells of liver cancer and ZR75-1 cells of breast cancer was observed by fluorescence microscope. Results double enzyme digestion and sequencing showed that pCMV-FLAG-CRP1 eukaryotic expression plasmid was successfully constructed to detect the expression of pCMV-FLAG-CRP1 in 293T cells, hepatocarcinoma HepG2 cells and breast cancer ZR75-1 cells by Western blot assay. CRP1 was distributed in the cytoplasm and nucleus of 293T HepG2G 2 + ZR75-1 cells, and the cytoplasmic signal was stronger than that in the nucleus. Conclusion pCMV-FLAG-CRP1 eukaryotic expression vector can be successfully constructed to express cytoplasm and nucleus in different cells.
【作者單位】： 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所;解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院腫瘤一科;解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科;
【基金】：國(guó)家自然科學(xué)基金(30872939,31100604,81101065)
【分類號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2200928