【摘要】：輸液可以應(yīng)對(duì)很多臨床上的狀況,從整個(gè)世界來(lái)看,對(duì)輸液的需求越來(lái)越高。但是獻(xiàn)血資源是一種短缺的資源,而且伴隨著很多副作用。這些都驅(qū)使人們?nèi)ふ乙环N全血的替代品用于輸液治療。其中很重要的一種思路就是使用無(wú)細(xì)胞的重組血紅蛋白來(lái)做為氧載體,即重組血紅蛋白類(lèi)氧載體。對(duì)于重組血紅蛋白類(lèi)氧載體的研究已經(jīng)有多年的歷史,本文在前人的基礎(chǔ)上提出一種新的構(gòu)建重組血紅蛋白類(lèi)氧載體的方式,通過(guò)構(gòu)建白蛋白血紅蛋白融合蛋白以及在血紅蛋白基因中引入點(diǎn)突變來(lái)克服重組血紅蛋白類(lèi)氧載體輸入人體后會(huì)引起的副作用。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建白蛋白血紅蛋白α融合蛋白,從而顯著增大該重組血紅蛋白的分子量,降低腎毒性。另一方面在血紅蛋白基因中引入三個(gè)定點(diǎn)突變,降低其與NO結(jié)合的能力,從而解決重組血紅蛋白類(lèi)氧載體輸入人體內(nèi)會(huì)引起的高血壓?jiǎn)栴}。然后體外表達(dá)該重組血紅蛋白類(lèi)氧載體。方法與結(jié)果:本實(shí)驗(yàn)用一段短的Linker DNA將白蛋白與血紅蛋白α基因連接起來(lái),并采用重疊延伸PCR的方法在人血紅蛋白基因中引入三個(gè)定點(diǎn)突變。選取合適的酶切位點(diǎn),將白蛋白血紅蛋白α基因以及血紅蛋白β基因連入原核雙表達(dá)載體pETDuet1中,隨后將構(gòu)建好的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株Origami DE3中,用IPTG誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)成功的構(gòu)建出了一種重組血紅蛋白雙表達(dá)載體,并在特定的大腸桿菌表達(dá)菌株中成功的表達(dá)出了該重組血紅蛋白基因。本實(shí)驗(yàn)為以后進(jìn)一步純化該重組血紅蛋白并用于臨床實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:Infusion can cope with many clinical conditions, and the need for infusion is increasing throughout the world. But blood donation is a scarce resource with many side effects. All this drives people to look for a whole-blood substitute for infusion therapy. One of the most important ideas is to use cell-free recombinant hemoglobin as oxygen carrier, that is, recombinant hemoglobin oxygen-like carrier. There have been many years of research on the recombinant hemoglobin oxygen-like carrier. This paper proposes a new way to construct the recombinant hemoglobin oxygen-like carrier on the basis of previous studies. By constructing albumin hemoglobin fusion protein and introducing point mutation into hemoglobin gene, the side effects caused by recombinant hemoglobin oxygen-like vector were overcome. Objective: to construct the albumin hemoglobin 偽 fusion protein, and to increase the molecular weight of the recombinant hemoglobin and reduce the nephrotoxicity. On the other hand, three site-directed mutations were introduced into the hemoglobin gene to reduce its ability to bind to no, thus solving the problem of hypertension caused by the introduction of the recombinant hemoglobin oxygen-like vector into human body. Then the recombinant hemoglobin oxygen-like vector was expressed in vitro. Methods and results: in this experiment, a short Linker DNA was used to link albumin with hemoglobin 偽 gene, and three site-directed mutations were introduced into human hemoglobin gene by overlapping extended PCR. The albumin hemoglobin 偽 gene and hemoglobin 尾 gene were linked into the prokaryotic expression vector pETDuet1, and the constructed expression vector was transformed into the E. coli expression strain Origami DE3. The expression of target gene was induced by IPTG. In this experiment, a recombinant hemoglobin double expression vector was successfully constructed, and the recombinant hemoglobin gene was successfully expressed in a specific Escherichia coli expression strain. This study laid a foundation for further purification and clinical application of the recombinant hemoglobin.
【學(xué)位授予單位】：江蘇師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R3411;Q78

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本文編號(hào)：2197909