【摘要】：IFITMs是由干擾素刺激基因編碼的Ⅱ型跨膜蛋白,為膜相關宿主限制因子。該家族成員中的IFITM1、IFITM2和IFITM3為免疫相關IFITM,在多種組織和細胞中廣泛表達,參與體內(nèi)多種生理活動。自1996年以來,IFITMs抗病毒活性及機制已成為研究熱點。大量研究表明,IFITMS夠抑制多種囊膜病毒的感染,包括甲型流感病毒、人類免疫缺陷病毒以及新出現(xiàn)的寨卡病毒等。IFITM3作為其家族成員之一,對抑制甲型流感病毒感染發(fā)揮至關重要的作用。據(jù)報道,IFITM3可通過干擾網(wǎng)格蛋白介導的病毒-宿主細胞膜融合過程抑制流感病毒進入,但具體機制尚不清楚。因此,本研究基于Tet-On 3G系統(tǒng),構建了含有人IFITM3基因的真核表達質(zhì)粒pLVX-TRE3G-IFITM3;并與調(diào)控質(zhì)粒pLVX-Tet3G共轉染MDCK細胞,轉染后48 h用G418和嘌呤霉素進行加壓篩選,Dox對獲得的細胞系進行誘導表達鑒定,并進行Dox敏感性分析、IFITM3+細胞百分數(shù)及定位分析。結果顯示,成功篩選出可誘導表達人IFITM3的MDCK細胞系,且IFITM3表達量與誘導時間和Dox使用濃度相關;確定Dox工作濃度為2.5μg/mL,誘導12 h時IFITM3+細胞數(shù)達75%以上,且IFITM3在晚期內(nèi)體/溶酶體存在分布;其次,將擴增出的流感病毒HA5、HA7和NA9基因分別連接到真核表達載體pcDNA 3.1上,轉染293細胞鑒定IFITM3的表達。然后利用本課題組優(yōu)化建立的第三代慢病毒包裝質(zhì)粒系統(tǒng),制備了以攜帶螢光素酶報告基因的HA5和HA7為外膜的假型病毒顆粒(H5N9pv-Luc,H7N9pv-Luc),通過螢光素酶活性及感染實驗檢測其感染性。結果顯示,HA5、HA7和NA9轉染后在細胞內(nèi)可有效表達且包裝獲得的假型病毒具有感染活性�；谝陨涎芯炕A,以H5N9pv-Luc或H7N9pv-Luc及H5N1禽流感病毒為感染模型,分別利用siRNA干擾、螢光素酶分析、自行建立的禽流感病毒實時熒光定量PCR檢測方法、熒光分子標記病毒及流式細胞術等方法進行病毒感染、進入及融合實驗研究,從正反兩方面證實IFITM3抑制流感病毒HA介導的病毒進入及膜融合,抑制病毒的復制及感染。綜上所述,IFITM3對流感病毒HA5和HA7介導的病毒進入具有抑制活性,為繼續(xù)探索其中的具體作用機制奠定了堅實的基礎。
[Abstract]:IFITMs is a type 鈪，

本文編號：2155372