發(fā)布時間：2018-06-23 03:08

  本文選題：霍亂弧菌 + 活的非可培養(yǎng)狀態(tài)��； 參考：《中國疾病預防控制中心》2016年博士論文

【摘要】：為了在不利的環(huán)境中保持存活的能力,霍亂弧菌會進入一種活的非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài)。VBNC這一現象已經被認識30年了,但對研究者來說依然是待解開的謎團。為了更好的認識這一現象,我們以霍亂弧菌為模式菌,設計并實施了以下三個方面的研究來解釋這一現象。在第一個部分的研究中,我們利用propidium monoazide(PMA)結合熒光定量PCR對VBNC狀態(tài)的霍亂弧菌01群埃爾托性菌株C6706進行定量分析。首先對108/mL的鮮活細胞、死亡細胞和VBNC細胞對不同的PMA處理程序進行時間-劑量-反應關系分析。結果顯示最優(yōu)的PMA處理方案為20μM孵育20分鐘,因為這可以最大限度的去除死亡細胞,但對鮮活細胞和VBNC細胞幾乎沒有影響。然后,我們評價了該方案在處理不同濃度細菌時的穩(wěn)定性和檢出下限,發(fā)現初始細菌的濃度對PMA處理的效果有很大影響。我們開發(fā)了一種利用108/mL的外源死細胞懸液來對抗初始細胞濃度副作用的方法。利用這個方案,消除了初始細胞濃度過低的影響,得到了穩(wěn)定的計數結果,并將該方法對VBNC細胞計數的檢出下限提升至10拷貝/μL。在第二部分的研究中,我們逐一評價了實驗室常規(guī)使用的VBNC誘導條件的5個組成因素對VBNC誘導的影響,即菌株差異、生長期差異、通氧差異、不同的溫度以及饑餓。其中菌株差異、生長期差異和通氧差異不影響VBNC狀態(tài)的形成,但是影響其發(fā)展過程�；魜y弧菌O1群古典型的菌株比埃爾托型菌株進入VBNC的速度要快。以平臺期細胞為初始細胞完全進入VBNC的時間(LCT100)要晚于對數期細胞。但是在誘導前期,對數期細胞可培養(yǎng)菌數下降的速度卻比平臺期要慢,這提示平臺期細胞狀態(tài)的不均一性可能在起作用。在誘導過程中,通氧可以快速使霍亂弧菌喪失可培養(yǎng)的能力,厭氧環(huán)境下的可培養(yǎng)細菌數可達到通氧條件的106倍。其余的兩個因素(較高的溫度和富營養(yǎng))卻可以阻止霍亂弧菌VBNC狀態(tài)的發(fā)生。在22℃和37℃誘導時,霍亂弧菌快速喪失可培養(yǎng)能力,在可培養(yǎng)細菌數分別達到106/mL和105/mL時維持恒定�；罹鷶岛涂偩鷶档慕Y果表明在這兩個溫度下,喪失可培養(yǎng)能力的霍亂弧菌沒有進入VBNC狀態(tài),而是不斷死亡和降解。當在ASW中加入LB時,VBNC的誘導也被阻止,但加入低營養(yǎng)的M9不影響。這表明LB和M9不同的成分可能會抑制VBNC的誘導。在第三部分的研究中,我們發(fā)現群體感應系統(tǒng)(QS)可以對抗霍亂弧菌VBNC狀態(tài)的誘導。利用轉座子突變技術,我們篩選到了一株在4℃ASW中可培養(yǎng)能力被延長的突變株,并發(fā)現該菌株的轉座子插入位點為rpoN基因。進一步研究發(fā)現受rpoN基因調節(jié)的hapR基因被失活后,菌株進入VBNC狀態(tài)的進程明顯加快。而高表達HapR可以延緩霍亂弧菌可培養(yǎng)能力的喪失。缺失qrrs,lux0和rpoN均可使可培養(yǎng)細菌存在的時間相比hapR缺失株延長50天以上。然后我們發(fā)現野生株也利用上調表達hapR來對抗其在VBNC誘導過程中可培養(yǎng)能力的喪失。在野生株誘導過程中hapR的轉錄上調,使其可培養(yǎng)細菌存在的時間比hapR缺失株延長10天。當hapR缺失株回補hapR基因后,其hapR的轉錄和表達水平,以及可培養(yǎng)能力的變化群恢復到野生株水平。在天然QS突變株中,高表達HapR表現為對VBNC誘導過程中可培養(yǎng)能力喪失的抵抗;低表達或無表達HapR則表現為可培養(yǎng)能力喪失的加速。這些菌株的存在表明了生態(tài)環(huán)境的壓力對霍亂弧菌QS進化的影響。這些研究將有助于將來對VBNC狀態(tài)如何發(fā)生發(fā)展機制的研究。同時也幫助深入認識在VBNC誘導過程中霍亂弧菌進行了哪些生命活動,以及環(huán)境壓力對不同VBNC發(fā)展能力的菌群的篩選。
[Abstract]:In the study of the first part , we evaluated the stability and the lower limit of VBNC . In the study of the second part , we evaluated the stability and the lower limit of the initial cell concentration .
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378.3

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本文編號：2055484