本文選題：鼠疫耶爾森氏菌 + Ⅲ型分泌系統(tǒng)�。� 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2017年博士論文

【摘要】：本論文涉及兩個部分,即《鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究》和《鼠疫耶爾森氏菌蛋白質組學分析及新毒力因子的鑒定。摘要及正文將分為兩個部分撰寫。摘要一 鼠疫耶爾森氏菌III型分泌系統(tǒng)蛋白YscI-YscF相互作用的研究III型分泌系統(tǒng)(Type III Secretion System,T3SS)是一種高度保守的毒力機制,廣泛分布于革蘭氏陰性菌中,能夠將效應蛋白直接分泌到宿主細胞的細胞質中。該系統(tǒng)的結構類似于一支注射器,由兩部分組成,分別是橫跨于細菌內膜、周質及外膜的多環(huán)基座以及將毒力蛋白輸送到宿主細胞內的中空針頭。鼠疫菌的T3SS由pCD1質粒編碼而成,是由20余種蛋白質構成的一種超分子復合物,含有許多高度保守結構,通過耗能將分泌性V抗原(LcrV)和耶爾森氏菌外膜蛋白(Yersinia outer proteins,Yops)由宿主細胞表面形成的小孔結構注入到宿主細胞內,從而達到干擾細胞發(fā)揮其正常生理功能的目的。鼠疫菌的pCD1質粒共編碼90多個基因,除去部分假基因和轉座酶相關基因后,共57個基因編碼T3SS相關蛋白。在本實驗室的前期工作中,已通過酵母雙雜交陣列篩選技術篩選到57個蛋白之間的21個相互作用對,其中新發(fā)現12對,包括YscF-YscI。YscF的多聚體在細菌表面形成注射小體的針狀結構,YscI是連接T3SS裝置分泌通道內外環(huán)的蛋白。前期實驗中已采用GST-pull down驗證了YscI-YscF體外存在相互作用,并通過構建Ysc I截短突變體的方法確定介導二者體外相互作用的結構域位于YscI的第83-92位氨基酸。本研究中,將通過免疫共沉淀等方法繼續(xù)驗證YscF-YscI的體內相互作用關系,并探討其相互作用的生理功能。首先,本研究利用λ-Red重組系統(tǒng)構建鼠疫菌yscI基因突變株。再以阿拉伯糖誘導的pBAD24質粒為載體構建帶FLAG標簽的yscI互補株及yscI截短突變體,并將成功構建的新載體導入yscI突變株,分別為△yscI-FLAG-YscI、△yscI-C△73-85、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102和△yscI-C△93-102。接下來,運用免疫共沉淀(Co-IP)的方法在FLAG樹脂結合下來的樣品中檢測到了YscF蛋白,驗證了YscI-YscF在體內存在相互作用;并使用同樣的實驗方法對不同突變菌株進行檢測,結果,對△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102菌株的Co-IP實驗中,FLAG樹脂結合下來的樣品中未檢測到YscF蛋白。以上結果說明,影響YscI-Ysc F體內相互作用的關鍵結構域位于YscI蛋白C末端的第83-102位氨基酸。本研究分別運用YscF聚合體交聯的方法檢測上述構建的yscI互補株以及yscI截短突變株在細菌表面組裝YscF針狀結構的能力;運用WB免疫印跡的方法檢測其表達及分泌YscI、YscF以及效應蛋白YopN、YopM、Yop E、YopK和LcrV的能力。結果表明:鼠疫菌yscI互補株和yscI截短突變株均可以在菌體內表達Ysc I和YscF,但不能分泌到上清中;在△yscI、△yscF和△yscI-C△83-92的菌體表面未檢測到YscF多聚體,在其分泌上清中也未檢測到效應蛋白;在△yscI-C△93-102細菌表面能檢測到YscF多聚體,但該菌株不能夠正常分泌效應蛋白。以上結果闡明,當YscI的第83-92位氨基酸缺失時,該突變株不能形成針狀結構且無法分泌效應蛋白;當第93-102位氨基酸缺失時,該菌株組裝YscF針狀結構的能力受到一定影響,但其分泌效應蛋白的功能并未完全喪失。針對YscI的83-92位氨基酸區(qū)域進行序列比對結果發(fā)現Ysc I的第85、86、88和92位氨基酸與YscF同源性高。因此,本研究構建了C末端帶有FLAG標簽的yscI點突變體,并導入yscI突變株,分別為△yscI-CW85A、△yscI-CS86A、△yscI-CI88A以及△ysc I-CI92A。利用免疫共沉淀方法檢測與YscF體內相互作用,結果在對△yscI-CW85A、△yscI-CS86A菌株的Co-IP實驗中,FLAG樹脂結合下來的樣品中未檢測到YscF蛋白。利用GST-pull down方法檢測與YscF體外相互作用,結果發(fā)現YscI-W85A或YscI-S86A與YscF未發(fā)生結合。以上結果表明,YscI第85或86位氨基酸的缺失,同時影響了YscI與YscF之間體內外的相互作用。本研究進一步發(fā)現無法在△yscI-CW85A和△yscI-CS86A的細菌表面檢測到YscF多聚體,也無法在其上清中檢測到效應蛋白。這一結果闡明,YscI的第85或86位氨基酸缺失導致YscI-YscF失去相互作用,并且該突變株也不能形成針狀結構和分泌效應蛋白。本研究還通過觀察細菌感染Hela細胞后形態(tài)的變化,以及用無標記細胞實時定量分析法研究鼠疫菌yscI截短及點突變株的細胞毒性。在顯微鏡下,我們看到野生株鼠疫菌感染3h后的Hela細胞明顯變圓,表明效應蛋白破壞細胞骨架;而△yscI、△yscF、△yscI-C△83-92、△yscI-C△93-102、△yscI-CW85A以及△yscI-CS86A感染的Hela細胞形態(tài)更接近于正常細胞,這說明以上菌株對Hela細胞的毒力作用已大幅度減弱。本研究還利用免疫印跡的方法檢測了yscI截短及點突變株感染Hela細胞后向胞內轉運效應蛋白的能力,結果表明對HeLa細胞毒力明顯減弱的幾株突變株同樣不能將效應蛋白Lcr V、Yop M和Yop E轉運到細胞胞漿中。摘要二 鼠疫耶爾森氏菌蛋白質組學分析及新毒力因子的鑒定鼠疫(plague)是由鼠疫耶爾森氏菌引起的烈性傳染病,主要由節(jié)肢動物跳蚤通過叮咬傳染給宿主嚙齒類動物,并有可能傳播給人導致腺鼠疫、肺炎鼠疫和敗血癥等的發(fā)生,給人們造成了巨大的生命和財產損失。本研究利用蛋白質組技術,在鼠疫菌全基因組測序已完成的基礎上,對鼠疫菌201株在兩種不同的生理條件下,即26°C含鈣(模擬跳蚤體內環(huán)境)和37°C低鈣(模擬哺乳動物體內環(huán)境)的蛋白質組展開研究,并進一步發(fā)現鼠疫菌致病的新的關鍵毒力因子,為防治鼠疫菌和新疫苗研究提供更多方法和靶標。首先,本研究制備出鼠疫菌在26°C含鈣和37°C低鈣培養(yǎng)條件下的分泌蛋白質組和菌體蛋白質組。該過程主要使用TMH人工合成培養(yǎng)基培養(yǎng)鼠疫菌,在兩種條件下培養(yǎng)8h,然后使用超濾法進行上清蛋白的濃縮,菌體用含尿素裂解液裂解,并用BCA試劑盒測量菌體蛋白和上清蛋白的濃度。此外,為了實現對鼠疫菌T3SS不同蛋白質組分的動態(tài)監(jiān)控,在8h分泌時間內選擇了一系列時間點作為分泌時間,分別為,80min、160min、240min、320min、400min和480min,制備出不同時間序列的分泌蛋白質組及菌體蛋白質組樣品。在本研究中,我們通過同量異序化學標簽(Tandem Mass Tags,TMT)法對樣品進行定量分析。TMT是通過串聯質譜同時定量鑒定不同樣品中蛋白質的有效工具。這些小化學分子標簽的結構類似,以共價結合賴氨酸的氨基末端的方式標記蛋白樣品中的多肽。在質譜分析中,每種分子量的TMT標簽都能生成一個特殊的離子圖譜,通過比較不同標簽標記的離子的相對豐度實現了對蛋白的相對定量。我們共檢測到2141個鼠疫菌蛋白質,占基因組預測CDS的52.2%。其中1081個蛋白質同時出現在分泌和菌體蛋白質組中。將Score≥5和Unique Peptide≥2作為定義潛在分泌蛋白的標準,共在培養(yǎng)上清中檢測到767個分泌蛋白,其中Yp-2058、Yp-3657和Yp_3415-Yp_3418幾種未知功能的蛋白在37°C表達上調,可能與鼠疫菌在宿主動物中的毒力密切相關。在研究T3SS的分泌蛋白動態(tài)變化實驗中,根據不同時間序列的蛋白質組樣品的質譜結果分析,未觀察到鼠疫菌T3SS蛋白組分隨時間的蛋白特異性變化規(guī)律,推測可能是由于最短分泌時間80min時,分泌蛋白質種類已基本趨于穩(wěn)定。本研究建立了一種新方法分辨哪些蛋白是T3SS的分泌蛋白,即將上清/菌體的PSM值大于1作為分泌蛋白的評判標準。發(fā)現根據上清/菌體的PSM值大于1為標準判斷鑒定出的T3SS分泌底物的蛋白,均是文獻中已經報道的分泌蛋白;而那些比值小于1的蛋白為T3SS結構蛋白、ATP酶以及轉運蛋白等。在分子實驗部分中,針對篩選出的高表達分泌蛋白質Yp_3416、Yp_3417、Yp_3418、Yp_2058和Yp_3657進行毒力及功能的驗證。本研究采用基于p DS132自殺載體的方法構建yp_3416、yp_3418和yp_3416-3418的無痕突變株。分別以尾靜脈感染途徑和滴鼻感染途徑對小鼠進行攻毒實驗,繪制出生存曲線。結果表明,經尾靜脈感染后,鼠疫菌野生株與yp_3416突變株,yp_3416-3418突變株的生存曲線差異有統(tǒng)計學意義,與yp_3418突變株無差異;滴鼻感染結果中,野生株與以上3株突變株的差異均有統(tǒng)計學意義。本研究還構建出yp_3416、yp_3417、yp_3418、yp_2058和yp_3657的β-內酰胺酶(TEM)報告質粒,導入鼠疫菌野生株后,分別感染Hela細胞。當靶蛋白進入宿主細胞時,與靶蛋白融合表達的β-內酰胺酶可降解細胞內CCF2-AM染料分子,在409nm光的照射下發(fā)出447nm的藍光;而靶蛋白未進入細胞時,完整的CCF2-AM具有熒光能量共振轉移現象,在409nm光的照射下發(fā)出520nm的綠光。利用該原理,研究Yp_3416、Yp_3417、Yp_3418、Yp_2058和Yp_3657五種靶蛋白能否被轉運到真核細胞內。結果表明,以上五種蛋白均能轉運到真核細胞內,且轉運效率較高。這一結果為新鑒定分泌蛋白質因子功能的后續(xù)研究奠定了基礎。
[Abstract]:This paper deals with the interaction between YscI - YscF and YscI - YscF . The results showed that YscI - CW85A , 鈻，

本文編號：1989388