本文選題：CRISPR + PECAM-1��； 參考：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：目的：PEC AM-1是一個(gè)分子量為130k的蛋白,屬于免疫球蛋白超家族的成員之一,主要在造血細(xì)胞系上以及單層內(nèi)皮細(xì)胞—細(xì)胞間隙處表達(dá)。有研究表明,PEC AM-1的胞內(nèi)段在內(nèi)皮細(xì)胞中有多重調(diào)控功能。PEC AM-1的胞內(nèi)段是內(nèi)皮細(xì)胞機(jī)械應(yīng)答反應(yīng)的必要條件,還對(duì)凋亡刺激起到細(xì)胞保護(hù)作用,并與細(xì)胞連接處其他的粘附蛋白和細(xì)胞骨架分子相互作用。而以上功能不依賴于位于胞內(nèi)段的免疫受體抑制性基序。鑒于胞內(nèi)段的堿基長(zhǎng)度,可以推測(cè)其他堿基可能在上述過(guò)程中起到作用。所以本課題的研究目的是探究PEC AM-1的胞內(nèi)段是否參與內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞邊界定位和內(nèi)皮屏障功能的維持,以維持血管的完整性。方法：用CRISPR基因編輯技術(shù)建立PEC AM-1敲除的永生化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系,稱為PE-KO;通過(guò)兩條sgRNA以在原位切除PEC AM-1胞內(nèi)段的基因,以得到表達(dá)ΔCD-PECAM-1的細(xì)胞,稱為ΔCD-iHUVECs。因?yàn)閮?nèi)皮細(xì)胞有轉(zhuǎn)染效率低的特點(diǎn),我們用含有兩條sgRNA和Cas9核酸酶cDNA的慢病毒感染iHUVECs。在用嘌呤霉素選擇性培養(yǎng)慢病毒感染的細(xì)胞后,iHUVECs被流式細(xì)胞儀分選為單個(gè)克隆。隨后分別用PECAM-1胞外段和胞內(nèi)段特異性的抗體,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析鑒定所得克隆細(xì)胞。為測(cè)定ΔCD-PECAM-1的功能,用共聚焦免疫熒光觀察其在內(nèi)皮細(xì)胞中的邊界定位,用電細(xì)胞—基質(zhì)阻抗傳感儀評(píng)估屏障功能,用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定PECAM-1/IgG結(jié)合能力以確定同嗜性結(jié)合能力。結(jié)果：我們成功建立并鑒定了兩個(gè)獨(dú)特的iHUVECs細(xì)胞系：一個(gè)徹底敲除了PEC AM-1表達(dá),另一個(gè)細(xì)胞系表達(dá)ΔCD-PECAM-1。共聚焦顯微鏡顯示ΔCD-PECAM-1可定位于融合內(nèi)皮細(xì)胞的邊界。與表達(dá)WT PECAM-1的細(xì)胞相比,表達(dá)ΔCD-PECAM-1的iHUVECs有更高的靜息阻抗,而PECAM-1敲除的iHUVECs的靜息阻抗則顯著下降。用凝血酶破壞內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能后,表達(dá)ΔCD-PECAM-1的細(xì)胞則能更快的恢復(fù)屏障,而PE-KO的恢復(fù)速率卻顯著低于表達(dá)WT-iHUVECs。最后,與表達(dá)WT PECAM-1的細(xì)胞相比,在iHUVECs上表達(dá)的ΔCD-PECAM-1與PECAM-1/IgG的親和性則明顯下降。結(jié)論：PECAM-1這一細(xì)胞粘附信號(hào)受體,在內(nèi)皮細(xì)胞—細(xì)胞邊界處聚集的能力,并不依賴于其胞內(nèi)段的表達(dá)。而ΔCD-PECAM-1與其它PECAM-1分子有較低的同嗜性結(jié)合親和力,這導(dǎo)致表達(dá)ΔCD-PECAM-1的內(nèi)皮細(xì)胞有更高的靜息屏障功能,以及在凝血酶刺激后,能更快的重建內(nèi)皮細(xì)胞邊界的完整性。綜上所述,以上結(jié)果表明PECAM-1胞內(nèi)段可能與內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白相互作用,從而限制了它在內(nèi)皮細(xì)胞膜平面的移動(dòng)性。而缺乏胞內(nèi)段的PECAM-1得到釋放,有更大的移動(dòng)性,從而能更好的維持內(nèi)皮細(xì)胞—細(xì)胞間隙的完整性。
[Abstract]:Objective: AM-1 is a 130k protein, which belongs to the immunoglobulin superfamily. It is expressed mainly in hematopoietic cell lines and the endothelial cell-cell intercellular space of monolayer. Studies have shown that the intracellular segment of PEC AM-1 has multiple regulatory functions in endothelial cells. The intracellular segment of PEC AM-1 is a necessary condition for the mechanical response of endothelial cells, and also plays a cytoprotective role in apoptosis stimulation. It also interacts with other adhesion proteins and cytoskeleton molecules at cell junctions. These functions are independent of the immunoreceptor inhibitory motifs located in the intracellular domain. Given the length of the base in the intracellular segment, it can be speculated that other bases may play a role in the above process. Therefore, the purpose of this study is to explore whether the intracellular segment of PEC AM-1 is involved in endothelial cell-cell boundary localization and endothelial barrier function maintenance, in order to maintain the integrity of blood vessels. Methods: the immortalized human umbilical vein endothelial cell line (PE-KOO) with PEC AM-1 knockout was established by CRISPR gene editing technique, and 螖 CD-iHUVECs was obtained by in situ excision of PEC AM-1 intracellular segment by two sgRNA. Because of the low transfection efficiency of endothelial cells, lentivirus containing two sgRNA and Cas9 nuclease cDNA was used to infect iHUVECs. After selective culture of lentivirus infected cells with purine mycin, iHUVECs were separated into a single clone by flow cytometry. The cloned cells were identified by flow cytometry with specific antibodies of extracellular and intracellular segments of PECAM-1. In order to determine the function of 螖 CD-PECAM-1, the boundary localization of 螖 CD-PECAM-1 in endothelial cells was observed by confocal immunofluorescence. The barrier function was evaluated by electrocell-matrix impedance sensor and the binding ability of PECAM-1/IgG was determined by flow cytometry. Results: we successfully established and identified two unique iHUVECs cell lines: one completely knocked out the expression of PEC AM-1 and the other expressed 螖 CD-PECAM-1. Confocal microscopy showed that 螖 CD-PECAM-1 could locate the boundary of fused endothelial cells. Compared with the cells expressing WT PECAM-1, the iHUVECs expressing 螖 CD-PECAM-1 has a higher resting impedance, while the PECAM-1 knockout iHUVECs has a significantly lower resting impedance. After thrombin was used to destroy endothelial cell barrier function, the cells expressing 螖 CD-PECAM-1 could recover the barrier more quickly, while the recovery rate of PE-KO was significantly lower than that of WT-iHUVECs. Finally, compared with the cells expressing WT PECAM-1, the affinity of 螖 CD-PECAM-1 expressed on iHUVECs to PECAM-1/IgG decreased significantly. Conclusion the ability of the cell adhesion signal receptor: 1 PECAM-1 to gather at the endothelial cell-cell boundary does not depend on the expression of its intracellular segment. However, 螖 CD-PECAM-1 has lower affinity to other PECAM-1 molecules, which leads to higher resting barrier function of endothelial cells expressing 螖 CD-PECAM-1, and faster reconstruction of endothelial cell boundary integrity after thrombin stimulation. In conclusion, the above results suggest that the intracellular segment of PECAM-1 may interact with the endothelial cytoskeleton protein, thus limiting its mobility in the endothelial cell membrane plane. However, PECAM-1, which lacks the intracellular segment, is released and has greater mobility, thus maintaining the integrity of the endothelial cell-cell space.
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392

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8 苑t，

本文編號(hào)：1962369