發(fā)布時(shí)間：2018-05-26 14:57

  本文選題：蛋白質(zhì)化學(xué)合成 + 一鍋法多片段縮合　； 參考：《清華大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：蛋白質(zhì)化學(xué)合成是人工獲取生物技術(shù)難以獲得的蛋白質(zhì)的有效手段。它能夠在原子精度層面實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)的任意改造,提供定點(diǎn)翻譯后修飾(甲基化,乙�；�,磷酸化,泛素化等)蛋白質(zhì),對(duì)不同物理刺激(光,磁等)響應(yīng)的蛋白質(zhì)探針,以及蛋白質(zhì)藥物用于生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究。特別地,化學(xué)合成光控蛋白質(zhì)探針能夠高時(shí)空分辨的控制蛋白質(zhì)的活性,而被廣泛應(yīng)用于研究高度動(dòng)態(tài)的生命過(guò)程,比如細(xì)胞的定向運(yùn)動(dòng),細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)等。然而,蛋白質(zhì)化學(xué)合成還需要進(jìn)一步發(fā)展方法以提高蛋白質(zhì)合成的效率,并進(jìn)一步擴(kuò)展化學(xué)合成的蛋白質(zhì)在生命科學(xué)的應(yīng)用。本論文將介紹作者在博士期間發(fā)展的高效率化學(xué)合成蛋白質(zhì)的新方法,及化學(xué)合成光控蛋白質(zhì)探針在研究免疫細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的應(yīng)用。蛋白質(zhì)化學(xué)合成近期的一個(gè)重要的方法進(jìn)展就是發(fā)展一鍋法多肽片段連接技術(shù),克服由分離純化連接中間產(chǎn)物帶來(lái)的產(chǎn)率低和耗時(shí)費(fèi)力的問(wèn)題,以提高蛋白質(zhì)化學(xué)合成的效率。雖然一鍋法三片段連接技術(shù)已經(jīng)被建立,卻沒(méi)有有效的一鍋法更多片段(比如四片段)的縮合策略。本論文作者發(fā)展了一種穩(wěn)健而高效的,基于對(duì)pH值敏感的新型N端Cys保護(hù)基——三氟乙酰氨甲基(Tfacm)的一鍋法四片段蛋白合成策略。利用該策略,本論文作者成功的實(shí)現(xiàn)了一鍋法四片段合成模型蛋白Crambin和人源趨化因子hCCL21�；赥facm的一鍋法四片段化學(xué)合成蛋白質(zhì)的策略,為化學(xué)合成更大,更復(fù)雜的蛋白質(zhì)提供一種有力的手段。在發(fā)展蛋白質(zhì)化學(xué)合成方法的基礎(chǔ)上,本論文作者發(fā)展了高時(shí)空分辨的系統(tǒng)研究免疫細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)和活化早期的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。作者化學(xué)合成雙光子光控的趨化因子探針(hCCL5**),通過(guò)體外雙光子解籠鎖(0.1μm2)及共聚焦顯微鏡單細(xì)胞成像技術(shù),證明了PI3K在T細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)過(guò)程中不決定方向的感知,而影響細(xì)胞的持續(xù)性運(yùn)動(dòng)。同時(shí),作者在小鼠表皮和淋巴組織內(nèi)首次實(shí)現(xiàn)了利用雙光子激活的探針hCCL5**人為的控制T細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和分布。此外,作者化學(xué)合成了光控蛋白抗原探針(HEL-K_(96)NPE),實(shí)現(xiàn)了光掩蔽極強(qiáng)相互作用(20 pM結(jié)合力)和極大相互作用面(1800?2)的抗體(HyHEL-10)-抗原(HEL)相互作用。并通過(guò)全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM),實(shí)現(xiàn)了對(duì)B細(xì)胞活化早期B細(xì)胞受體微簇形成和鈣離子震蕩反應(yīng)等信號(hào)傳導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)測(cè)量。這些光控蛋白探針為進(jìn)一步理解和調(diào)控免疫細(xì)胞的功能提供了高分辨的分子工具。
[Abstract]:Protein chemical synthesis is an effective method to obtain protein which is difficult to be obtained by biological technology. It can transform proteins arbitrarily at the atomic precision level, providing fixed-point post-translational modification (methylation, acetylation, phosphorylation, ubiquitin, etc.) proteins, protein probes that respond to different physical stimuli (light, magnetism, etc.). And protein drugs for life sciences and biomedical research. In particular, chemically synthesized photo-controlled protein probes can control the activity of proteins in high spatial and temporal resolution, and are widely used to study highly dynamic life processes, such as cell directional movement, intracellular signal transduction, and so on. However, protein chemical synthesis needs to be further developed to improve the efficiency of protein synthesis, and to further expand the application of chemically synthesized proteins in the life sciences. This paper will introduce a new method of high efficiency chemical synthesis of proteins developed by the author during his Ph.D. and the application of chemically synthesized photo-controlled protein probes in studying the mechanism of signal transduction in immune cells. One of the most important methods of protein chemical synthesis is the development of one-pot peptide fragment binding technology to overcome the problems of low yield and time-consuming caused by the separation and purification of ligated intermediate products in order to improve the efficiency of protein chemical synthesis. Although the one pot three fragment linking technique has been established, there is no effective condensation strategy for more fragments (e. G. Four fragments) in one pot method. In this paper, the authors have developed a stable and efficient one-pot four-fragment protein synthesis strategy based on a novel N-terminal Cys protection group, trifluoroacetamethylammonium trifluoroacetylmethyl (Tfacm), which is sensitive to pH value. Using this strategy, the author successfully implemented the one-pot four-fragment synthesis of model protein Crambin and human chemokine hCCL21. The strategy of one-pot four-fragment chemical synthesis of proteins based on Tfacm provides a powerful means for chemical synthesis of larger and more complex proteins. On the basis of the development of protein chemical synthesis methods, the authors have developed a high space-time resolution system to study the early signal transduction processes of immune cells during their directional movement and activation. The authors have synthesized a chemically controlled chemokine probe hCCL5, using in vitro two-photon cage locking (0.1 渭 m ~ 2) and confocal microscope single cell imaging technique. The results show that PI3K does not determine the direction of T cell chemotaxis. And affects the cell's sustained movement. At the same time, in mouse epidermis and lymphoid tissues, the authors have for the first time realized the artificial control of T cell movement and distribution by using a two-photon activated probe hCCL5 *. In addition, the authors have chemically synthesized a photo-controlled protein antigen probe, HEL-KH _ (96) NPE, which realizes the interaction of the highly photomasking interaction (20 pm) and the maximal interaction surface (1800 ~ (2) with the antibody HyHEL-10 (antigen-hele). The kinetic measurements of signal transduction such as the formation of B cell receptor microclusters and Ca 2 + oscillation reaction in the early stage of B cell activation were carried out by means of total internal reflection fluorescence microscope (TIR). These light-controlled protein probes provide a high-resolution molecular tool for further understanding and regulating the function of immune cells.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R392;O657.3

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本文編號(hào)：1937657