本文選題：細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞 + 合體滋養(yǎng)層��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景新生命的孕育始于卵子和精子的結(jié)合。卵子和精子的受精發(fā)生在輸卵管的壺腹部,受精卵在輸卵管向子宮移動(dòng)的過(guò)程中經(jīng)歷卵裂發(fā)育為桑椹胚。在受精后4-5天發(fā)育為囊胚,此時(shí)已到達(dá)子宮腔,囊胚由位于內(nèi)部的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外部的滋養(yǎng)外胚層組成,日后滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胎盤(pán),內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育為胎兒。胎盤(pán)是一個(gè)臨時(shí)性器官,但是在母體整個(gè)妊娠過(guò)程中起著舉足輕重的作用。胎兒的正常發(fā)育離不開(kāi)胎盤(pán),胎盤(pán)是聯(lián)系母體與胎兒的紐帶,對(duì)于母胎的健康至關(guān)重要。胎盤(pán)的發(fā)生發(fā)育出現(xiàn)異常則會(huì)導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生,包括子癇前期(pre-eclampsia)、早期流產(chǎn)(first trimester miscarriage)和胎兒發(fā)育遲緩(fetal growth restriction),嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致胎兒死亡。因此,胎盤(pán)的正常發(fā)育和其功能的正常調(diào)控對(duì)于人類(lèi)妊娠過(guò)程中胎兒的正常發(fā)育非常重要。細(xì)胞融合是哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的生理過(guò)程,它參與受精、胎盤(pán)發(fā)育、骨骼肌和骨頭的發(fā)育以及免疫防御反應(yīng)。在卵子和精子結(jié)合的過(guò)程中,精子穿過(guò)透明帶后繼續(xù)穿過(guò)卵細(xì)胞的細(xì)胞膜,受精卵形成的這個(gè)過(guò)程發(fā)生了精子與卵細(xì)胞的融合。在人類(lèi)胎盤(pán)絨毛發(fā)育過(guò)程中,同樣也存在細(xì)胞融合事件的發(fā)生。囊胚種植入子宮后,接下來(lái)的胎盤(pán)發(fā)育開(kāi)始出現(xiàn)胎盤(pán)絨毛。在胎盤(pán)絨毛的形成過(guò)程中,細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞主要沿著兩條途徑分化。侵潤(rùn)遷移途徑：細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞(cytotrophoblast, CTB)分化為具有侵潤(rùn)能力的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(extravillouscytotrophoblast, EVT)向母體子宮發(fā)生侵潤(rùn);融合途徑：胎盤(pán)絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中有一類(lèi)具有增殖分化能力的細(xì)胞,這類(lèi)細(xì)胞可分裂為兩個(gè)細(xì)胞,其中一個(gè)與外圍的合體滋養(yǎng)層(syncytiotrophoblast, STB)發(fā)生融合,而另一個(gè)細(xì)胞繼續(xù)保持有絲分裂特性。在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合到合體滋養(yǎng)層的過(guò)程中,細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞不僅將其細(xì)胞核融進(jìn)合體滋養(yǎng)層,還有胞質(zhì)中的細(xì)胞器包括線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等所有物質(zhì)都進(jìn)入了合體滋養(yǎng)層。細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞不斷持續(xù)融入合體滋養(yǎng)層的這種特性能夠讓合體滋養(yǎng)層的表面積不斷擴(kuò)大,同時(shí)更新現(xiàn)有的合體滋養(yǎng)層,使得合體滋養(yǎng)層中老化的部分代謝到母體血液循環(huán)中完成自身的新陳代謝從而實(shí)現(xiàn)胎盤(pán)的發(fā)育和成熟。老化的內(nèi)容物和凋亡的物質(zhì)聚在一起形成合體滋養(yǎng)層結(jié)節(jié),這種結(jié)節(jié)將從合體滋養(yǎng)層排放到母體血液中從而維持的合體滋養(yǎng)層穩(wěn)態(tài)。這對(duì)于胎兒胎盤(pán)的新陳代謝是至關(guān)重要的。如果細(xì)胞融合失去控制,導(dǎo)致合體滋養(yǎng)層凋亡或壞死物質(zhì)大量的排到母體血液中則有可能引起母體妊娠炎癥反應(yīng)過(guò)度,導(dǎo)致妊娠疾病如子癇前期等的發(fā)生。胎盤(pán)是母體與胎兒進(jìn)行氣體交換、供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和排除代謝產(chǎn)物的場(chǎng)所。大約在受精后第3周末,絨毛內(nèi)的中胚層分化出毛細(xì)血管形成三級(jí)絨毛,此時(shí)開(kāi)始胎兒胎盤(pán)循環(huán)系統(tǒng)的建立。絨毛間隙充滿(mǎn)了由母體子宮螺旋動(dòng)脈提供的血液,子宮螺旋動(dòng)脈的血液富含氧氣及胎兒發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。位于絨毛外層的合體滋養(yǎng)層可與子宮螺旋動(dòng)脈血直接接觸,進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、代謝物和氣體的交換。同時(shí)合體滋養(yǎng)層還可以阻礙來(lái)自于母體病原體的進(jìn)入,如抵抗李斯特細(xì)菌等病原體。若合體滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)遭到破壞,來(lái)自母體血液的病原體則可能入侵,影響胎兒的生長(zhǎng)與發(fā)育。胎盤(pán)同時(shí)還是一個(gè)具有代謝和內(nèi)分泌功能的器官,可合成各種激素,包括絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin, hCG)、胎盤(pán)催乳素(human placental lactogen, hPL)、雌激素、孕激素和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子等。這些分子的正常合成及分泌對(duì)于胎盤(pán)的正常發(fā)育和功能的發(fā)揮以及妊娠的維持等各個(gè)方面起著至關(guān)重要的作用。氣體、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在母體與胎兒的正常交換、母體病原體進(jìn)入胎兒受到的阻礙以及以上激素的正常分泌依賴(lài)于合體滋養(yǎng)層結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育,形成良好的胎盤(pán)屏障結(jié)構(gòu),充分保證了胎兒發(fā)育的正常進(jìn)行。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition. EMT)是上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有活動(dòng)能力、能夠在細(xì)胞基質(zhì)間自由移動(dòng)的間質(zhì)細(xì)胞的過(guò)程。EMT中最典型的特征是E-cadherin的降低或缺失。研究發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄因子包括Snail、Slug、 ZEB1、ZEB2以及Twist1可通過(guò)抑制E-cadherin的表達(dá)促進(jìn)上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化。這些轉(zhuǎn)錄因子被稱(chēng)為EMT相關(guān)因子。本研究團(tuán)隊(duì)之前已報(bào)道Cullin7通過(guò)調(diào)控ZEB1和Slug的表達(dá),從而促進(jìn)胎盤(pán)絨毛中滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤(rùn)遷移,滋養(yǎng)層細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)化。其他研究也發(fā)現(xiàn)EMT相關(guān)因子,包括Twist1、Snail和Slug在胎盤(pán)絨毛中滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤(rùn)遷移分化過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。以上研究表明EMT相關(guān)因子(ZEB1、Twist1、Snail和Slug)在滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵潤(rùn)遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用,但這些EMT相關(guān)因子在絨毛中滋養(yǎng)層細(xì)胞分化的融合途徑中是否也發(fā)揮同樣重要的作用,這方面的研究報(bào)道不多。因此,本實(shí)驗(yàn)的研究目的主要是檢測(cè)EMT相關(guān)因子在胎盤(pán)絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞融合分化途徑中的作用。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究我們證實(shí)了轉(zhuǎn)錄蛋白Twist1參與了滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合分化過(guò)程,并在其中發(fā)揮著重要的作用。并首次研究發(fā)現(xiàn)了Twist1可在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控GCM1的表達(dá)從而促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合。EMT相關(guān)因子Twist1不僅在胎盤(pán)母胎界面促進(jìn)上皮.間質(zhì)的轉(zhuǎn)化,在滋養(yǎng)層細(xì)胞的另一條分化途徑中(融合途徑)同樣發(fā)揮重要的生理功能。這些研究結(jié)果將有助于我們進(jìn)一步了解胎盤(pán)滋養(yǎng)層融合發(fā)生及胎盤(pán)形成的分子機(jī)制。深入研究胎盤(pán)形成的生理機(jī)制為臨床上預(yù)防胎盤(pán)發(fā)育異常引起的妊娠相關(guān)疾病提供分子理論基礎(chǔ),更加深入了解妊娠相關(guān)疾病發(fā)生的病理機(jī)制,為日后治療妊娠相關(guān)疾病提供更多、更加有效的治療方法。第一部分Twist1在人類(lèi)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞融合過(guò)程中的作用[研究目的]通過(guò)檢測(cè)EMT相關(guān)分子在人類(lèi)胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化過(guò)程中的表達(dá)情況,探討EMT相關(guān)分子在人類(lèi)胎盤(pán)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞融合過(guò)程中的作用,有利于我們進(jìn)一步了解胎盤(pán)發(fā)育過(guò)程中滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合分化途徑。[研究方法]2014年5月至2015年5月從北京婦產(chǎn)醫(yī)院收集人類(lèi)胎盤(pán),包括妊娠早期人工流產(chǎn)絨毛(6-8周)、妊娠中期引產(chǎn)的正常胎盤(pán)(18-20周)和足月分娩的胎盤(pán)(38-40周)。從足月胎盤(pán)中分離原代滋養(yǎng)層細(xì)胞,建立原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化模型。原代滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)期間,收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢測(cè)p型人絨毛膜促性腺激素(p-hCG)的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平,運(yùn)用免疫熒光方法檢測(cè)原代滋養(yǎng)層細(xì)胞合胞體的形成確定原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化模型的成功建立。利用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)EMT相關(guān)因子(Twist1、Snail、Slug、ZEB1和ZEB2)在原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化過(guò)程中的表達(dá)變化。運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)EMT相關(guān)因子Twist1在妊娠早期絨毛、妊娠中期胎盤(pán)及足月胎盤(pán)的表達(dá)定位。通過(guò)蛋白免疫印跡方法檢測(cè)原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化過(guò)程中及forskolin (FSK)誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞融合過(guò)程中的Twist1的蛋白表達(dá)水平。使用特異性siRNA靶向抑制BeWo細(xì)胞中Twist1的表達(dá)24小時(shí),隨后FSK誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞融合48小時(shí)。觀察其對(duì)FSK處理的BeWo細(xì)胞融合過(guò)程的影響,包括合胞體的形成及β-hCG的蛋白表達(dá)水平。[研究結(jié)果](1)免疫熒光顯示原代滋養(yǎng)層細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中會(huì)自發(fā)聚集形成合胞體。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),滋養(yǎng)層細(xì)胞形成的合胞體越大,72小時(shí)后合胞體中的細(xì)胞核數(shù)可達(dá)10個(gè)以上。β-hCG的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平隨著滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化的進(jìn)程而逐漸升高。(2)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顯示EMT相關(guān)因子Twist1的mRNA水平在原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化過(guò)程中其表達(dá)顯著性升高,而其他EMT相關(guān)因子(Snail、Slug、ZEB1和ZEB2) mRNA水平顯著性降低。(3)在妊娠不同時(shí)期胎盤(pán)絨毛中轉(zhuǎn)錄因子Twist1主要表達(dá)在細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞、合體滋養(yǎng)層及絨毛間質(zhì)細(xì)胞,具有明顯的核定位信號(hào)。(4)Western blotting顯示原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化過(guò)程中,Twist1的蛋白表達(dá)水平在24小時(shí)已明顯升高并持續(xù)至72小時(shí)。FSK誘導(dǎo)Be Wo細(xì)胞融合過(guò)程中,與對(duì)照組相比較(DMSO), Twist1的蛋白表達(dá)水平升高。(5)特異性siRNA靶向抑制Twist1的表達(dá),與對(duì)照組(scrambled siRNA)相比較,FSK處理的BeWo細(xì)胞的β-hCG蛋白表達(dá)水平降低,形成的合胞體數(shù)減少,融合指數(shù)顯著降低。[研究結(jié)論](1)足月胎盤(pán)分離得到的原代滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)融合形成合胞體,表明了人胎盤(pán)原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化模型的成功建立。(2)EMT相關(guān)因子Twist1的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平隨著原代滋養(yǎng)層細(xì)胞自發(fā)合體化的進(jìn)程而升高,并且在妊娠不同時(shí)期的胎盤(pán)絨毛中的細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層都有明顯的核定位信號(hào)。提示了Twistl可能參與了合體滋養(yǎng)層的形成。(3)利用人絨毛膜癌滋養(yǎng)層細(xì)胞系BeWo細(xì)胞進(jìn)行功能實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)靶向抑制Twistl的表達(dá)后,抑制FSK誘導(dǎo)的BeWo細(xì)胞融合,融合指數(shù)顯著降低,且合成分泌的β-hCG減少。進(jìn)一步證實(shí)了Twist1在滋養(yǎng)層細(xì)胞融合過(guò)程中的重要作用。第二部分Twist1通過(guò)調(diào)控GCM1表達(dá)促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合[研究目的]本課題第一部分已經(jīng)初步證實(shí)了在人類(lèi)胎盤(pán)絨毛發(fā)育過(guò)程中Twist1可促進(jìn)細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合發(fā)生。但目前對(duì)于Twist1調(diào)控滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)生融合的作用機(jī)制鮮有報(bào)道。GCM 1是目前公認(rèn)的可促進(jìn)人類(lèi)胎盤(pán)絨毛中細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞向合體滋養(yǎng)層發(fā)生融合的分子。本部分實(shí)驗(yàn)主要探討Twist1是否通過(guò)調(diào)控GCM1表達(dá)促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合,研究Twistl促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞融合的分子機(jī)制。[研究方法]運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)Twist1和GCM1在人類(lèi)早期妊娠絨毛中的表達(dá)定位。從人類(lèi)足月胎盤(pán)絨毛中分離得到的原代滋養(yǎng)層細(xì)胞分別在常氧(20%)和低氧(2%)條件下培養(yǎng)至72小時(shí),培養(yǎng)期間收集不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡方法檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下Twist1、GCM1和β-hCG的表達(dá)情況。使用特異性siRNA靶向抑制BeWo細(xì)胞中Twist1的表達(dá),然后FSK誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞融合48小時(shí)。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR觀察Twist1 siRNA對(duì)FSK處理的BeWo細(xì)胞融合過(guò)程中GCM1以及下游分子syncytin1和syncytin2的mRNA表達(dá)水平的影響。在293T細(xì)胞中共同轉(zhuǎn)染表達(dá)Twist1的質(zhì)粒及插入GCM1基因第二內(nèi)含子區(qū)域的報(bào)告質(zhì)粒,利用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了不同總量的Twist1質(zhì)粒對(duì)GCM1轉(zhuǎn)錄活性的影響。進(jìn)一步通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)研究Twist1蛋白與GCM1靶基因的相互作用。[研究結(jié)果](1)免疫組化結(jié)果顯示Twist1和GCM1在人類(lèi)妊娠早期絨毛中具有相似的表達(dá)定位,在妊娠早期絨毛的細(xì)胞滋養(yǎng)層和合體滋養(yǎng)層都有表達(dá),具有明顯的核定位信號(hào)。(2)與常氧(20%)培養(yǎng)條件相比,從足月胎盤(pán)分離得到的原代滋養(yǎng)層細(xì)胞在低氧(2%)條件中培養(yǎng)時(shí),融合能力受到影響,表現(xiàn)為β-hCG蛋白的表達(dá)水平受到抑制。在常氧(20%)培養(yǎng)條件下,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),原代滋養(yǎng)層細(xì)胞的Twist1蛋白表達(dá)水平升高及GCM1的mRNA水平顯著升高。而在低氧(2%)培養(yǎng)條件下,Twist1蛋白的表達(dá)水平及GCM1的mRNA水平同時(shí)受到抑制。(3)在人絨毛膜癌來(lái)源的細(xì)胞系BeWo細(xì)胞中特異性地敲低Twist1的表達(dá),GCM1在siRNA實(shí)驗(yàn)組的mRNA水平顯著降低。GCM1下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA實(shí)驗(yàn)組亦顯著降低。(4)在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了過(guò)表達(dá)Twist1質(zhì)粒和GCM1報(bào)告質(zhì)粒,熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Twist1影響了GCM1的轉(zhuǎn)錄活性,具有增強(qiáng)GCM1轉(zhuǎn)錄活性的作用,并且隨著轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Twist1質(zhì)�？偭康脑黾�,GCM1的轉(zhuǎn)錄活性也隨著升高。(5)BeWo細(xì)胞中加入FSK誘導(dǎo)融合48小時(shí)后,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Twist1可以與位于GCM1基因第二內(nèi)含子中的E-box序列結(jié)合。[研究結(jié)論](1)Twist1和GCM1在妊娠早期絨毛中相似的表達(dá)定位,并且在不同氧氣濃度培養(yǎng)條件下,Twist1和GCM1表達(dá)水平的變化趨勢(shì)具有相似性,推測(cè)Twist1和GCM1之間是否存在可能的聯(lián)系。(2)在BeWo細(xì)胞中特異性敲低Twist1的表達(dá)后,GCM1及其下游分子syncytin 1和syncytin 2的mRNA水平在siRNA實(shí)驗(yàn)組顯著降低,提示Twist1可能通過(guò)調(diào)控GCM 1的表達(dá)促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合。(3)為了進(jìn)一步驗(yàn)證了以上假設(shè),通過(guò)熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Twist1可增強(qiáng)GCM1的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí),染色質(zhì)免疫共沉淀研究結(jié)果顯示Twist1可與GCM1基因的第2內(nèi)含子中富含E-box序列的區(qū)域結(jié)合。綜上所述,Twist1可能通過(guò)與GCM1基因第2內(nèi)含子中的E-box序列結(jié)合,從而調(diào)控GCM1的表達(dá),促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞的融合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R321

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本文編號(hào)：1872247