本文選題：曼氏迭宮絳蟲 + 裂頭蚴��； 參考：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：迭宮屬絳蟲的中絳期幼蟲——裂頭蚴,可寄生于人體引起裂頭蚴病,主要表現(xiàn)為幼蟲移行癥,累及全身,可導(dǎo)致失明、肢體麻痹、甚至死亡。裂頭蚴病呈世界性分布,但多見于東亞及東南亞國(guó)家。我國(guó)大部分地區(qū)均有人體裂頭蚴病報(bào)道,累計(jì)超過1 000例,病例數(shù)為世界之最。近年來(lái),裂頭蚴病的發(fā)病趨勢(shì)在部分地區(qū)呈上升態(tài)勢(shì),已被列為新現(xiàn)的動(dòng)物源性寄生蟲病。對(duì)我國(guó)的裂頭蚴種群進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)生生物地理學(xué)研究,不僅對(duì)于了解我國(guó)迭宮絳蟲種群的歷史演化過程有基礎(chǔ)性理論意義,而且對(duì)揭示它們?nèi)绾雾憫?yīng)氣候變化和環(huán)境變遷,從而對(duì)制定裂頭蚴病有效的防制策略具有指導(dǎo)意義。然而,目前關(guān)于我國(guó)裂頭蚴的種群遺傳多樣性其分化模式等方面的研究還較薄弱。本研究利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)有的歐猥迭宮絳蟲(Spirometra erinaceieuropaei)成蟲及裂頭蚴的ESTs開發(fā)了4個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星分子標(biāo)記,并利用這4個(gè)位點(diǎn)對(duì)我國(guó)西南11個(gè)地區(qū)的裂頭蚴類群進(jìn)行了種群遺傳多態(tài)性研究。材料與方法1.裂頭蚴標(biāo)本采集及鑒定:2014年5月至2015年9月,對(duì)我國(guó)四川、重慶和云南11個(gè)地區(qū)野生蛙體內(nèi)裂頭蚴的自然感染情況進(jìn)行調(diào)查,并對(duì)陽(yáng)性蛙體的裂頭蚴進(jìn)行收集,用無(wú)水乙醇密閉保存。利用通用型柱式基因組DNA提取試劑盒提取每一株標(biāo)本的基因組DNA,基于cox1分子標(biāo)記對(duì)采集的地理株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。2.微衛(wèi)星分子標(biāo)記開發(fā):首先利用NCBI_BLAST和UniVec數(shù)據(jù)庫(kù)掩蔽獲取自公共數(shù)據(jù)庫(kù)裂頭蚴相關(guān)ESTs中冗余序列,然后使用CD_HIT_EST在線工具對(duì)ESTs聚類,最后利用MISA遵照單核酸重復(fù)10次及以上、2核苷酸和3核苷酸4次及以上、4核苷酸及5核苷酸和6核苷酸3次及以上、長(zhǎng)度在100bp內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)查找微衛(wèi)星位點(diǎn)。選擇以3核苷酸和(或)4核苷酸模式為主且位點(diǎn)側(cè)翼序列符合引物設(shè)計(jì)要求的微衛(wèi)星作為目的序列。利用Primer3設(shè)計(jì)目的序列引物,通過小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)利用溫度梯度PCR、瓊脂糖凝膠電泳和PCR產(chǎn)物測(cè)序來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增序列與原位點(diǎn)序列的一致性和多態(tài)性。3.目的序列擴(kuò)增和測(cè)序:對(duì)確定與原位點(diǎn)序列一致且具有多態(tài)性的引物利用預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的PCR條件和體系對(duì)所有地理株進(jìn)行有效擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物一部分進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳加硝酸銀染色(即PAGE銀染),另一部分進(jìn)行微衛(wèi)星序列測(cè)序。4.PAGE及微衛(wèi)星序列數(shù)據(jù)處理:對(duì)于銀染數(shù)據(jù),使用GenePop在線模塊估算HO(觀測(cè)雜合度)、HE(期望雜合度)、H(基因多樣性)、哈德溫伯格平衡和連鎖不平衡檢驗(yàn)、群體內(nèi)近交系數(shù)Fis、固定系數(shù)Fst和總體近交系數(shù)Fit;使用Arlequin 3.5計(jì)算遺傳分化指數(shù)FST和G-W指數(shù)(Garza-Williamson index);使用GenALEx 6.5進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)和主坐標(biāo)分析(PCoA)。對(duì)于測(cè)序數(shù)據(jù),使用MEGA v.6.06進(jìn)行序列比對(duì)并對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行人工校正;使用DnaSP v.5.10進(jìn)行單倍型(Haplotype)分析并分別構(gòu)建不同微衛(wèi)星標(biāo)記的單倍型矩陣及多標(biāo)記聯(lián)合矩陣。5.遺傳多態(tài)性分析:使用DnaSP v.5.10計(jì)算各地理群的單倍型多態(tài)性及核苷酸多態(tài)性;使用Network v.4.5對(duì)各個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記及聯(lián)合序列進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)的重建;分別使用最大簡(jiǎn)約、最大似然及貝葉斯推斷法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。最大簡(jiǎn)約分析在MEGA v.6.06中進(jìn)行,樹的搜索策略采用啟發(fā)式搜索,分支交換法采用樹二等分再連接的分支交換法,系統(tǒng)樹每一分枝的置信度采用自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗(yàn),設(shè)置2000次重復(fù);使用PhyML軟件進(jìn)行最大似然分析,基因進(jìn)化模型用赤池信息量準(zhǔn)則在jModelTest 2中選擇模型,分枝的置信度采用自引導(dǎo)法重復(fù)檢驗(yàn),設(shè)置2000次重復(fù);采用MrBayes v3.1進(jìn)行貝葉斯分析,運(yùn)行1×108代,每100代對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行抽樣,使用收斂診斷法對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行重新評(píng)估,當(dāng)分離頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)差小于0.02時(shí)則認(rèn)為兩次運(yùn)行之間存在收斂。所有系統(tǒng)發(fā)育分析均運(yùn)算兩次。使用Arlequin3.5中岐點(diǎn)分布分析來(lái)評(píng)估裂頭蚴種群的動(dòng)態(tài)變化,并基于中性選擇理論,對(duì)不同種群進(jìn)行Fu’s FS檢測(cè)和Tajima’s D檢測(cè)。結(jié)果1.中國(guó)西南地區(qū)野生蛙類裂頭蚴自然感染率:自中國(guó)西南11個(gè)不同地區(qū)(四川南充、營(yíng)山、廣安、樂山、自貢、瀘州、達(dá)州、涼山州和云南昆明、保山及重慶梁平)共采集野生蛙類347只,經(jīng)鑒定均為黑斑蛙(Rana nigromaculata)。其中64只感染裂頭蚴,平均感染率為18.44%。不同地區(qū)裂頭蚴感染率從6.67%到36.36%不等,最多的1只感染31裂頭蚴,最少的感染1條。四川地區(qū)蛙類裂頭蚴感染率較高,其中又以南充的感染率最高,達(dá)36.36%。2.微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選和引物設(shè)計(jì):共獲得12 481條裂頭蚴相關(guān)ESTs,找到符合要求的微衛(wèi)星915條,平均約1 779個(gè)堿基中含有1條微衛(wèi)星位點(diǎn)。重復(fù)單元以單核苷酸為最多,占46.67%,其中重復(fù)大于15次的長(zhǎng)序列以A/T模式為主,小于15次的短序列以C/G為主;其次是2核苷酸,占31.26%,又以AC/GT和AG/CT豐度最高;再次是3核苷酸分別為16.72%,數(shù)量最多的是AGG/CCT模式;最后是占4.48%的4核苷酸模式以及合計(jì)不足1%的5核苷酸和6核苷酸。通過小樣本預(yù)實(shí)驗(yàn)從15個(gè)位點(diǎn)中篩選出了5個(gè)(C07、M15、I03、N11和M20)與預(yù)期位點(diǎn)序列一致的微衛(wèi)星分子標(biāo)記,經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其中4個(gè)(C07、M15、N11和M20)具有多態(tài)性。3.基于PAGE銀染數(shù)據(jù)的遺傳多態(tài)性分析:5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和64株裂頭蚴地理株共鑒定出13個(gè)等位基因,每個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記所鑒定出的等位基因數(shù)量為2~3個(gè)(平均2.60)。95%的地理株等位基因數(shù)不超過3個(gè),平均每個(gè)地理株每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)為1.89。I03位點(diǎn)上的雜合數(shù)量最少,只有18.75%,其次是N11位點(diǎn),占26.56%。四川廣安和南充地區(qū)具有最多的等位基因數(shù)(11個(gè)),平均等位基因數(shù)也最高(2.20),而四川達(dá)州和云南昆明的平均等位基因數(shù)最少(1.40),四川樂山在5個(gè)位點(diǎn)上均表現(xiàn)出多態(tài)性。所有地理株整體上總雜合度范圍為0~0.682(平均值為0.322),每個(gè)地理種群觀測(cè)雜合度(HO)的均值為0.436(范圍為0~1.000)。哈德溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明本研究的所有地理株是一個(gè)整體種群中的隨機(jī)個(gè)體(P0.05),且所選的微衛(wèi)星位點(diǎn)之間不存在連鎖不平衡(P0.05)。估算的Fis和Fit結(jié)果均為負(fù)值,表明群體觀測(cè)雜合度大于期望雜合度,群體內(nèi)存在雜交情況。在N11位點(diǎn)上群體間遺傳分化較弱(Fst0.05),I03位點(diǎn)上群體間遺傳分化較強(qiáng)(Fst0.25),C07、M20和M15為中等(0.05Fst0.15),所有位點(diǎn)上群體間遺傳分化處于中等水平(0.05Fst0.15)。而各地理群G-W指數(shù)平均值均大于臨界值0.68,表明整體上種群比較穩(wěn)定,不存在種群擴(kuò)張事件。AMOVA結(jié)果顯示變異主要來(lái)樣本個(gè)體之間,占總體的93%,在地理群之間的變異較小,只占7%。利用遺傳距離和地理距離進(jìn)行的PCoA分析顯示云南保山、昆明地理群與四川各地理群及重慶梁平間差距明顯,總體上可分為云南與四川+重慶兩個(gè)大的群體。在地理株的水平上,云南昆明、保山和四川達(dá)州間存在部分重疊,但不與其它地理群重疊,除達(dá)州外的四川各地理群之間和重慶梁平間均有重疊存在。4.基于序列的遺傳多態(tài)性分析:通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)I03的多態(tài)性來(lái)自微衛(wèi)星位點(diǎn)的側(cè)翼序列上,因此在基于微衛(wèi)星序列數(shù)據(jù)進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析時(shí)剔除了I03位點(diǎn)。在剩余的4個(gè)位點(diǎn)中,基于C07標(biāo)記共鑒定出4個(gè)單倍型,其中Hap1涵蓋17個(gè)地理株,Hap2涵蓋41個(gè)地理株,Hap3涵蓋5個(gè)地理株,Hap4只包含1個(gè)地理株;M15標(biāo)記共鑒定出9個(gè)單倍型,其中Hap1涵蓋46個(gè)地理株,Hap4涵蓋9個(gè)地理株,Hap6和Hap8分別包含2個(gè)地理株,Hap2、Hap3、Hap5、Hap7和Hap9均只有1個(gè)地理株;M20標(biāo)記共鑒定出7個(gè)單倍型,其中Hap1涵蓋10個(gè)地理株,Hap2和Hap7均涵蓋2個(gè)地理株,Hap3包含30個(gè)地理株,Hap4涵蓋13個(gè)地理株,Hap5涵蓋6個(gè)地理株,Hap6只包含1個(gè)地理株;N11標(biāo)記共鑒定出10個(gè)單倍型,其中Hap1涵蓋21個(gè)地理株,Hap2包含18個(gè)地理株,Hap3包含6個(gè)地理株,Hap4涵蓋9個(gè)地理株,Hap9涵蓋3個(gè)地理株,Hap8和Hap10均涵蓋2個(gè)地理株,Hap5、Hap6和Hap7均只有1個(gè)地理株;C07、M15、M20和N11總的單倍型多態(tài)性(Hd)及核苷酸多態(tài)性(Pi)分別為:0.175±0.061、0.00090±0.00032,0.468±0.072、0.01559±0.01007,0.553±0.057、0.00430±0.00062,0.581±0.064、0.00494±0.00077。分子差異度分析的結(jié)果顯示種群之間的遺傳差異度比種群內(nèi)的要高。分別使用最大簡(jiǎn)約法、最大似然法和貝葉斯推斷法對(duì)不同微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明,所有微衛(wèi)星標(biāo)記的單倍型均分為兩個(gè)主要分枝,其中,C07標(biāo)記的Hap4單獨(dú)形成一個(gè)分枝;M15標(biāo)記的Hap4和Hap5形成一個(gè)分枝;M20標(biāo)記的Hap2和Hap5形成一個(gè)分枝;N11標(biāo)記的Hap3、Hap4、Hap6和Hap7共同形成一個(gè)類群�；趩伪缎偷闹薪余徑泳W(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果也顯示西南地區(qū)裂頭蚴的存在兩個(gè)單倍型子網(wǎng)絡(luò),并且與系統(tǒng)進(jìn)化樹上的分枝相對(duì)應(yīng)。其中,C07標(biāo)記的Hap2是最主要的單倍型,頻數(shù)為41;M15標(biāo)記的Hap1是最主要的單倍型,頻數(shù)為46;M20標(biāo)記的Hap3是最主要的單倍型,頻數(shù)為30;N11標(biāo)記的Hap1和Hap2是最主要的單倍型,頻數(shù)分別為21和18。結(jié)論1.我國(guó)西南地區(qū)野生黑斑蛙體內(nèi)均存在裂頭蚴自然感染情況,平均感染率為18.44%;2.基于歐猥迭宮絳蟲成蟲和裂頭蚴的EST序列數(shù)據(jù)庫(kù),利用生物信息工具成功篩選出4組微衛(wèi)星標(biāo)記:C07、M15、M20和N11;3.PCoA分析結(jié)果表明我國(guó)西南地區(qū)裂頭蚴存在2個(gè)種群,且地理隔離對(duì)裂頭蚴的種群遺傳多態(tài)性影響較大;4.基于不同微衛(wèi)星標(biāo)記的單倍型分析結(jié)果表明,我國(guó)西南地區(qū)裂頭蚴種群的基因多態(tài)性水平較低;5.系統(tǒng)發(fā)育及單倍型網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果均提示西南地區(qū)裂頭蚴種群存在2種基因型,且這2種基因型在不同地理區(qū)域混合存在。
[Abstract]:In recent years , the research on the genetic structure and systematic biogeography of the population genetic diversity in China ' s Sichuan , Chongqing and Yunnan has been reported . Genetic polymorphism analysis was carried out by using DnaSP v.5 . 10 . The results showed that the number of alleles per microsatellite marker was only 18.75 % , and the number of alleles per microsatellite locus was at least 1 % . The number of alleles per microsatellite marker was 1 . 89 . Based on the genetic polymorphism analysis , there were only one geographic strain in the population , including two geographical strains , Hap2 , Hap3 , Happi5 , Happi7 and Hapten . The results of phylogenetic analysis showed that there were two main branches of C07 - labeled Hap3 , 0 . 01559 鹵 0 . 00032 , 0 . 468 鹵 0.072 , 0 . 01559 鹵 0 . 01007 , 0 . 553 鹵 0 . 057 , 0 . 00430 鹵 0 . 00062 , 0 . 581 鹵 0 . 064 , 0 . 00494 鹵 0 . 00077 .

【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R383.35
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本文編號(hào)：1831033