本文選題：CRISPR + Cas9�。� 參考：《華東師范大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：單基因遺傳病是因為體內(nèi)一個基因發(fā)生功能性突變而導(dǎo)致的。超過3000種人類疾病與單個基因突變相關(guān)。迄今為止,藥物仍然無法根治單基因遺傳病,基因治療成為治療單基因遺傳病的最佳手段。傳統(tǒng)的基因治療手段依賴病毒載體向體內(nèi)傳遞外源基因,從而替代體內(nèi)有缺陷的基因行使功能,但是這一方法存在諸多缺點。近年來興起的CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)因其操作簡便、基因定點修飾效率高等特點,在基因治療方面顯示出巨大潛力。CRISPR-Cas9技術(shù)的作用原理是在向?qū)NA引導(dǎo)下,由Cas9核酸酶識別基因組特異位點并對其進行切割的過程。由于CRISPR-Cas9技術(shù)操作簡便,效率高,已超越ZFNs與TALLEN成為基因編輯的首要工具,目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫、農(nóng)作物等研究。CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展的下一個目標(biāo)將是能廣泛在個體體內(nèi)清除或修復(fù)各種遺傳病致病基因的突變,從而達到緩解疾病病癥的目的。B型血友病是基因治療的理想模型,為此我們開展了CRISPR-Cas9技術(shù)在治療單基因遺傳病B型血友病的應(yīng)用研究。我們首先根據(jù)B型血友病家系中發(fā)現(xiàn)的F9基因的新型突變(第371位酪氨酸突變?yōu)樘於彼?設(shè)計模擬該突變的血友病小鼠模型。發(fā)現(xiàn)人源F9基因的第371位酪氨酸位點在各物種間是高度同源的,在小鼠體內(nèi)該位點位于F9基因的第381位氨基酸。通過向小鼠的一細胞期胚胎注射Cas9 mRNA,sgRNA與ssODN,成功構(gòu)建了模擬病人新突變的點突變小鼠F9Y381D。同時還構(gòu)建了模擬病人該位點已報導(dǎo)的F9Y381S突變小鼠,與第383位氨基酸突變?yōu)榻K止密碼子的敲除小鼠F9Y38STOP。通過對F9Y38ID突變小鼠及另外兩種突變小鼠進行活化凝血酶原時間與尾部凝血實驗的測定,我們確定病人來源的F9基因的Y371D新型突變比已報導(dǎo)的Y371S突變具有更強的致病性。接著,我們利用構(gòu)建好的血友病小鼠模型進行基因治療的研究。通過流體動力學(xué)的注射方法向成體小鼠尾靜脈注射用于表達Cas9蛋白與sgRNA的質(zhì)粒,及用于同源重組的DNA(雙鏈或單鏈)模板,以期修復(fù)肝臟細胞中F9基因的Y381D突變。發(fā)現(xiàn)經(jīng)過注射治療后的FqY38ID小鼠的活化凝血酶原時間縮短,尾部凝血實驗的存活率提高,而且注射質(zhì)粒并沒有引起肝臟內(nèi)的免疫反應(yīng)。經(jīng)過對肝臟細胞的測序分析,發(fā)現(xiàn)肝臟細胞內(nèi)單鏈模板組有0.56%(或雙鏈模板組有1.55%)的F9等位基因被修復(fù),提示只要修復(fù)肝臟細胞內(nèi)0.56%的F9基因即可緩解B型血友病的病情。為了提高肝臟細胞的基因修復(fù)率,我們引入感染能力更強的腺病毒載體。在向成體小鼠尾靜脈注射表達Cas9蛋白,sgRNA及攜帶同源重組模板的腺病毒后,我們發(fā)現(xiàn)雖然腺病毒系統(tǒng)在肝臟細胞內(nèi)修復(fù)了5.5%的F9基因,然而卻沒有縮短F9Y38ID小鼠的活化凝血酶原時間。通過對肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶、炎癥因子的檢測、及肝臟細胞形態(tài)的觀察,我們發(fā)現(xiàn)腺病毒系統(tǒng)會引起肝臟內(nèi)劇烈的免疫反應(yīng),可能是導(dǎo)致腺病毒治療無效果的原因。綜上所述,我們的研究表明通過Cas9基因編輯技術(shù)原位修復(fù)F9基因突變治療B型血友病的可行性,也為基因編輯技術(shù)應(yīng)用于單基因遺傳病的治療提供了有力的實驗支持。
[Abstract]:In recent years , the gene therapy has been widely used in the research of gene therapy . It has been widely used in the research of gene therapy .

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R554.1;R-332

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本文編號：1807468