本文選題：HIV-1 + 表位　； 參考：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院》2015年博士論文

【摘要】：人類免疫缺陷病毒(HIV-1)感染已造成世界范圍內(nèi)數(shù)千萬人致病甚至死亡,嚴重威脅著人類健康。發(fā)展能預防和阻斷HIV-1感染的疫苗一直是HIV-1研究的核心科學問題。然而,HIV-1極易發(fā)生突變并可通過多種方式逃避機體的免疫系統(tǒng);同時,HIV-1亞型眾多,不同地域的人群感染的HIV-1亞型具有不同的流行特點,不同人種的HLA限制性也相差甚遠,這些因素都使得HIV-1疫苗的研發(fā)困難重重。迄今為止,國內(nèi)外已經(jīng)開展了大量HIV-1疫苗相關(guān)研究并取得一定的進展,但仍未研發(fā)出一種安全、有效的疫苗。因此,仍然需要采取不同的發(fā)展策略進行HIV-1疫苗的深入研究。本研究針對中國大陸地區(qū)病毒亞型的流行特點以及中國人群HLA限制性特征,開展以表位為基礎(chǔ)的疫苗設(shè)計研究,著眼于設(shè)計發(fā)展一種中國人群適用的HIV-1候選疫苗。本研究擬通過生物信息分析技術(shù),篩選在HIV-1中國主要流行病毒株中序列高度保守而且符合中國人群優(yōu)勢MHC限制性的表位;進行多表位疫苗的優(yōu)化設(shè)計和構(gòu)建;利用多個不同品系的小鼠模型進行疫苗免疫效果評價;并結(jié)合HIV-1臨床感染者的細胞標本評價HIV-1多表位疫苗的人群適用性及在HIV-1預防和治療方面的應(yīng)用潛力。1.具有中國人MHC限制性特征的HIV-1表位篩選及多表位疫苗設(shè)計(1)候選表位的篩選及鑒定:為了篩選獲得理想的表位用于疫苗設(shè)計,通過文獻調(diào)研及數(shù)據(jù)庫分析,篩選符合下列要求的表位:1)、表位位于env、gag及pol基因編碼的蛋白上;2)、表位在中國主要流行株(China B、CRF01_AE、CRF07_BC及CRF08_BC)中高度保守;3)、表位的MHC限制性與中國人群優(yōu)勢分布的HLA基因型一致。利用軟件分析表位的MHC限制性及序列保守性,最終獲得9個符合條件的CTL表位,分別位于Gag(6個)、Env(2個)及Pol(1個)蛋白上,并選取了一段位于Env蛋白上的由36個氨基酸組成的Th表位富集區(qū)。(2)多表位核酸疫苗的優(yōu)化設(shè)計、構(gòu)建及鑒定:為了獲得多表位疫苗的最優(yōu)化設(shè)計,以上述篩選獲得的九個CTL表位及一段Th表位富集區(qū)為基礎(chǔ),通過調(diào)整表位的串聯(lián)順序和呈現(xiàn)方式以及選用不同類型的表位間連接子,嘗試多種多表位設(shè)計組合,并選擇3個具有代表性的疫苗設(shè)計組合(MEG1、MEG2、MEG3),構(gòu)建相應(yīng)的真核表達質(zhì)粒。通過生物軟件分析三種設(shè)計的序列結(jié)構(gòu)特征,通過細胞轉(zhuǎn)染檢測三種質(zhì)粒的體外表達能力,通過動物實驗評價三種質(zhì)粒的體內(nèi)免疫原性。結(jié)果表明,p JW4303-MEG1與p JW4303-MEG2序列特征相似,均在體外正常表達并在體內(nèi)誘導產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng);而p JW4303-MEG3不但其預測分析的結(jié)構(gòu)特征與前兩者顯著不同,而且體外轉(zhuǎn)染結(jié)果及體內(nèi)免疫學檢測結(jié)果均呈陰性。上述結(jié)果說明連接子的種類是多表位疫苗設(shè)計的主要影響因素之一,以柔性連接子“GGGS”的效果更優(yōu)。(3)多表位核酸疫苗p JW4303-MEG1的免疫原性分析及保護效果評價:為了評價核酸疫苗p JW4303-MEG1的免疫效果,以BALB/c小鼠為對象進行核酸免疫,評價該候選疫苗誘導的單肽特異性免疫反應(yīng)及免疫記憶。結(jié)果表明該質(zhì)粒能有效誘導小鼠產(chǎn)生針對所有H-2d限制性表位的單肽免疫反應(yīng),誘導的長期免疫記憶能維持至少一年。進一步以重組病毒r TTV-lucgag進行小鼠攻毒,通過檢測小鼠體內(nèi)病毒嗜性組織的熒光素酶活性強度評價p JW4303-MEG1的免疫保護效果,結(jié)果表明免疫組小鼠體內(nèi)的病毒含量與對照組相比雖然沒有統(tǒng)計學差異,但病毒含量有明顯的下降趨勢。上述結(jié)果說明MEG1多表位疫苗設(shè)計策略為優(yōu)化的疫苗設(shè)計方案,對應(yīng)的核酸疫苗p JW4303-MEG1具有良好的免疫原性。2.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1在BALB/c小鼠體內(nèi)的免疫學評價(1)多表位蛋白疫苗MEP1的制備及鑒定:為了制備獲得高純度的多表位候選蛋白疫苗MEP1,首先將大腸桿菌密碼子優(yōu)化的多表位序列插入到原核表達載體p QE30上構(gòu)建重組表達質(zhì)粒p E30-MEG1并酶切鑒定;小量誘導摸索最適誘導條件并鑒定,目的蛋白MEP1主要以包涵體形式表達;大量誘導制備獲得含有MEP1蛋白的包涵體,8M脲溶解后利用Ni+柱親和層析法純化并進一步復性濃縮;利用SDS-PAGE及WB檢測蛋白的純度及特異性,最終成功制備高純度的目的蛋白MEP1,可用于后續(xù)實驗。(2)蛋白MEP1在BALB/c雌性小鼠體內(nèi)的免疫學特征評價:為了評價重組蛋白MEP1誘導的免疫反應(yīng)水平和免疫保護效果,以BALB/c雌性小鼠為對象,三次免疫后檢測免疫反應(yīng)并開展攻毒保護實驗。ELISA結(jié)果表明MEP1能誘導高水平的特異性抗體;ELISPOT結(jié)果表明MEP1與鋁鹽佐劑聯(lián)合免疫能有效誘導Th1/Th2平衡的細胞免疫應(yīng)答及單肽特異性免疫反應(yīng);攻毒實驗結(jié)果表明重組蛋白MEP1誘導的免疫反應(yīng)具有一定的保護效果,能有效降低小鼠卵巢中的模式病毒r TTV-lucgag的含量。另外,該重組蛋白可快速誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,小鼠單次免疫后10天即可產(chǎn)生特異性細胞免疫反應(yīng)。(3)小鼠性別對重組蛋白MEP1誘導的免疫反應(yīng)的影響分析:為了評價性別因素對蛋白MEP1誘導免疫反應(yīng)的影響。以BALB/c雄性小鼠為對象,進行蛋白免疫并進行免疫評價。結(jié)果表明,蛋白MEP1在雄性小鼠體內(nèi)也能有效誘導體液免疫和細胞免疫產(chǎn)生。與雌性小鼠的免疫應(yīng)答水平相比,雄性小鼠產(chǎn)生的抗體滴度和Th2型細胞免疫應(yīng)答水平略低,Th1型細胞免疫應(yīng)答水平則與雌性小鼠相當。蛋白在雄性小鼠體內(nèi)同樣具有抗病毒r TTV-lucgag效果,說明重組蛋白MEP1對不同性別的小鼠均可誘導有效的保護性免疫應(yīng)答。3.HIV-1多表位蛋白疫苗MEP1誘導的人MHC限制性免疫反應(yīng)特征研究(1)蛋白MEP1在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的免疫應(yīng)答特征研究:為了驗證蛋白MEP1誘導的細胞免疫應(yīng)答與表位MHC限制性之間的相關(guān)性,以A2/DR1及A11/DR1轉(zhuǎn)基因小鼠為對象并以基因本底C57BL/6小鼠為對照,蛋白聯(lián)合鋁鹽佐劑免疫三次后進行免疫評價。ELISPOT實驗及流式細胞術(shù)分析結(jié)果均表明蛋白誘導的細胞免疫應(yīng)答與MHC限制性有顯著關(guān)聯(lián),轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的免疫反應(yīng)強度及單肽特異性反應(yīng)廣度均顯著優(yōu)于C57BL/6對照小鼠。進一步以A2/DR1小鼠為對象檢測蛋白免疫對小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的影響,流式細胞術(shù)分析結(jié)果表明重組蛋白能改變機體的免疫細胞構(gòu)成比并上調(diào)APC細胞表面的MHC-II類分子的表達,進而影響細胞免疫反應(yīng)。(2)蛋白MEP1對HIV-1感染者PBMCs的體外刺激效果評價:為了進一步驗證蛋白MEP1誘導的免疫反應(yīng)與MHC限制性的相關(guān)性,并探索該蛋白在中國人群中的適用性,以HIV-1確診感染者的PBMCs樣本為對象,進行蛋白MEP1體外刺激。ELISPOT結(jié)果顯示HIV-1感染者的PBMCs在蛋白刺激后能顯著分泌細胞因子IFN-γ及IL-2,而正常人的PBMCs在蛋白刺激后則表現(xiàn)為陰性反應(yīng)。后續(xù)分析結(jié)果表明,重組蛋白MEP1作用于不同MHC限制性人群和不同治療階段的病人,均能有效誘導細胞免疫,預示該多表位蛋白疫苗在中國人群中適應(yīng)性好。4.結(jié)論本研究篩選獲得了符合中國人群優(yōu)勢MHC限制性并在HIV-1中國主要流行株中高度保守的9個CTL表位和一段Th表位富集區(qū)。以此為基礎(chǔ)開展HIV-1多表位候選疫苗的優(yōu)化設(shè)計,實驗研究發(fā)現(xiàn),表位間連接子是多表位疫苗設(shè)計中的關(guān)鍵影響因素之一。本研究設(shè)計和發(fā)展了一種HIV-1候選多表位蛋白疫苗MEP1,該蛋白在小鼠模型中表現(xiàn)出良好的免疫原性和免疫保護性,并且能有效刺激HIV-1感染者的PBMCs產(chǎn)生免疫反應(yīng)。該蛋白誘導的免疫反應(yīng)與MHC限制性密切相關(guān)并且在中國人群中適用性好。本研究不僅為研發(fā)安全有效的HIV-1疫苗提供了新思路,同時也建立了一套系統(tǒng)的表位疫苗設(shè)計及評價體系,為其他病原疫苗設(shè)計提供了參考。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：1770302