本文選題：NK92細(xì)胞 + K562細(xì)胞��； 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell,NK)細(xì)胞是一種是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞,其增殖、成熟和存活等生物學(xué)特性受細(xì)胞內(nèi)外復(fù)雜的信號(hào)調(diào)控。細(xì)胞信號(hào)分子的調(diào)控除了受磷酸化等調(diào)控外,蛋白水平的翻譯后修飾也非常重要。小類泛素化修飾(small ubiquitin-like modifier,SUMO)蛋白化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾方式,影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的活性和細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)。SUMO特異性蛋白酶1(SUMO-specific proteinase 1,SENP1)是一個(gè)調(diào)控蛋白SUMO化的重要蛋白酶,能夠促進(jìn)SUMO的成熟和將SUMO分子與蛋白解離,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)蛋白穩(wěn)態(tài)而影響細(xì)胞的增殖、分化和周期。已知SENP1調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子HIF等影響紅系造血細(xì)胞的生成,但其對(duì)NK細(xì)胞生物學(xué)特性影響并不清楚。白細(xì)胞介素21(IL-21)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子,主要由激活的CD4+細(xì)胞產(chǎn)生。NK細(xì)胞IL-21R在靜息和激活狀態(tài)下的NK細(xì)胞都有表達(dá),IL-21對(duì)NK細(xì)胞的增殖和功能起到調(diào)節(jié)作用。但SENP1是否參與IL-21的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及調(diào)控NK細(xì)胞的生物學(xué)特性作用有待闡明。本文從IL-21對(duì)NK細(xì)胞SENP1的表達(dá)調(diào)控及其對(duì)增殖、存活和殺傷活性等方面進(jìn)行了闡述。研究目的:(1)觀察IL-21對(duì)NK92細(xì)胞表達(dá)SENP1的誘導(dǎo)作用(2)檢測(cè)干涉SENP1對(duì)NK92細(xì)胞凋亡、增殖的影響(3)探究干涉SENP1對(duì)NK92細(xì)胞殺傷活性的影響。研究方法:(1)在缺乏IL-2的培養(yǎng)體系中加入IL-21刺激NK92細(xì)胞,用CCK8試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的增殖情況;用利用Annexin V-APC/PI標(biāo)記檢測(cè)細(xì)胞的凋亡;并使用qRT-PCR、免疫印跡的方法檢測(cè)SENP1在NK92細(xì)胞中的表達(dá)情況。(2)使用攜帶Senp1-shRNA的慢病毒感染NK92細(xì)胞后,使用流式細(xì)胞儀以及熒光顯微鏡檢測(cè)感染效率,并同時(shí)使用qRT-PCR、免疫印跡的方法確認(rèn)干涉效率。(3)以感染對(duì)照病毒的NK92細(xì)胞為參照,使用慢病毒shRNA干涉Senp1后利用CCK8試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)NK92細(xì)胞系的增殖情況,利用Annexin V-APC/PI標(biāo)記細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干涉Senp1后NK92細(xì)胞凋亡。(4)使用慢病毒shRNA干涉Senp1后用qRT-PCR方法檢測(cè)殺傷因子的表達(dá)。(5)將帶熒光素酶標(biāo)記的K562細(xì)胞與NK92細(xì)胞共培養(yǎng),用熒光素酶報(bào)告基因的方法檢測(cè)NK92細(xì)胞的殺傷活性。研究結(jié)果:(1)IL-21刺激能夠明顯上調(diào)NK92細(xì)胞表達(dá)SENP1,并且IL-21上調(diào)NK92細(xì)胞表達(dá)SENP1具有量效關(guān)系。(2)IL-21抑制NK92細(xì)胞的凋亡,能夠減緩乏IL-2導(dǎo)致的NK92細(xì)胞死亡的數(shù)目,且與IL-21的濃度具有相關(guān)性。(3)與感染對(duì)照病毒NK92細(xì)胞比較發(fā)現(xiàn),在感染慢病毒shRNA后,NK92細(xì)胞Senp1在mRNA表達(dá)降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在蛋白水平中,SENP1的表達(dá)也受到了明顯的抑制。(4)慢病毒感染細(xì)胞凋亡24h,Senp1干涉組細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組比較,干涉Senp1可以促進(jìn)NK92細(xì)胞凋亡。(5)使用CCK8方法檢測(cè)細(xì)胞的增殖變化后發(fā)現(xiàn)干涉Senp1后可以顯著抑制NK92細(xì)胞增殖,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。(6)與病毒感染對(duì)照組比較,Senp1干涉組NK92細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞的殺傷活性增強(qiáng),顆粒酶B、IFN-γ表達(dá)降低,穿孔素的表達(dá)顯著升高。結(jié)論:IL21能夠提高NK92細(xì)胞表達(dá)SENP1,抑制NK92細(xì)胞的凋亡,減少乏IL-2導(dǎo)致的NK92死亡的數(shù)目。干涉Senp1不僅促進(jìn)NK92細(xì)胞凋亡,還能抑制增殖,同時(shí)影響穿孔素表達(dá)和對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R392

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本文編號(hào)：1761247