瘧原蟲TatD-like DNase的功能分析及與蟲體致病性的相關性分析
本文選題:瘧原蟲 切入點:脫氧核糖核酸酶 出處:《吉林大學》2016年博士論文
【摘要】:瘧原蟲對宿主的危害主要發(fā)生在血液期,即蟲體在宿主紅細胞內的發(fā)育繁殖過程。然而,多年來對瘧原蟲的生物學及致病機理的解析一直存在著很多空白。這影響著疫苗的研制和抗瘧藥物的開發(fā)。在本實驗中,我們通過生物信息學分析首先分析潛在的能降解宿主免疫細胞胞外陷阱ETs(Extracellular Traps)結構的分泌性DNase,即Tat D-like DNase,并分析其基序,結構域和序列特性。結果顯示,瘧原蟲的Tat D-like DNAse是一種金屬依賴性的脫氧核糖核酸酶,其蛋白質在不同瘧原蟲中的序列非常保守,并且在N端存在一個20個氨基酸左右的信號肽,這說明該蛋白質具有分泌的潛力。進一步,對Pf Tat D在瘧原蟲紅內期的轉錄表達水平進行分析。用q PCR的方法對不同時期編碼Pf Tat D基因的轉錄水平進行分析;同時對Pf Tat D在瘧原蟲紅內期的表達水平進行western blot分析。結果顯示,Pf Tat D在瘧原蟲紅內期全程轉錄表達,并且在32小時達到轉錄高峰。我們采用間接免疫熒光和免疫電鏡的方法定位Pf Tat D在染蟲紅細胞內的位置。定位結果與生物信息學預測相符,蛋白質存在于納蟲溶泡膜與染蟲紅細胞膜之間,并且具有向外分泌的趨勢。在鼠瘧原蟲相關實驗中,我們發(fā)現Tat D的轉錄與表達和蟲體的毒力成正相關,這也說明了該蛋白質在蟲體致病中的作用。進一步我們采用double crossover的方法敲除了P.berghei ANKA株編碼Pb Tat D的基因,獲得了缺陷表達Tat D的蟲株。對缺陷蟲株的毒力分析結果顯示,缺陷表達蟲株的感染能力和致死性都明顯下降。而將缺陷表達蟲株與巨噬細胞J774A.1體外共培養(yǎng),發(fā)現該蟲株可以誘導巨噬細胞產生ETs結構,并且產生的數量明顯高于野生型蟲株。這個結果說明了,瘧原蟲Tat D參與了蟲體逃避宿主ETs清除的過程。而在酶活實驗中,原核表達的Tat D蛋白質可以體外降解宿主DNA,這也進一步驗證了Tat D參與蟲體致病性逃避宿主清除機理的假說,即蟲體將Tat D蛋白質釋放到胞外,通過其脫氧核糖核酸酶的活性降解宿主產生的ETs結構中的DNA骨架來逃避其殺傷性作用。我們通過對小鼠免疫重組Pb Tat D和Pc Tat D蛋白質評價該蛋白質的免疫保護性。結果顯示免疫組的染蟲率要低于空白組和陰性組,并且小鼠的存活時間更長。而血清治療實驗的結果也與免疫保護試驗的結果相符。以上結果顯示,該蛋白質作為一個蟲體致病相關蛋白質,參與了蟲體逃避宿主天然免疫的過程,并且具有作為紅內期疫苗的候選抗原的潛力。本研究首次揭示了Tat D-like DNase蛋白質作為瘧原蟲致病相關蛋白質,參與蟲體逃避NETs清除的過程,這對深入理解瘧原蟲逃避宿主天然免疫具有重要的意義,也為研制瘧疾疫苗提供了新的思路。
[Abstract]:The harm of Plasmodium to the host mainly occurs in the blood phase, that is, the development and reproduction of the parasite in the host erythrocyte. However, Over the years, there have been many gaps in the analysis of the biological and pathogenic mechanisms of Plasmodium. This has affected the development of vaccines and antimalarial drugs. By bioinformatics analysis, we first analyzed the secretory DNase, or Tat D-like DNase, which can degrade the host immune cell extracellular trap (ETs(Extracellular traps) structure, and analyzed its motif, domain and sequence properties. The Tat D-like DNAse of Plasmodium is a metal-dependent deoxyribonuclease, its protein is very conserved in different plasmodium, and there is a signal peptide of about 20 amino acids at the N-terminal. This indicates that the protein has the potential to secrete. Furthermore, the transcriptional expression level of PF Tat D in the erythroid phase of Plasmodium is analyzed. The transcription level of PF Tat D gene at different stages is analyzed by Q PCR method. At the same time, the expression of PF Tat D in the erythroid phase of Plasmodium was analyzed by western blot. The results showed that the expression of PF Tat D was transcriptional in the whole process of the erythrocytic phase of Plasmodium falciparum. We used indirect immunofluorescence and immunoelectron microscopy to locate the position of PF Tat D in the erythrocytes of the parasite. The localization results were consistent with the bioinformatics prediction. The protein exists between the foam membrane and the erythrocyte membrane, and has the tendency of exocrine secretion. We found that the transcription and expression of Tat D was positively correlated with the virulence of the parasite in the related experiments of Plasmodium falciparum. Further, we used double crossover method to knock out the gene encoding Pb Tat D of P.berghei ANKA strain, and obtained the strain with defective expression of Tat D. the virulence analysis to the defective strain showed that, The infection ability and lethal ability of the defective expression insect strain were obviously decreased, but co-cultured with macrophage J774A.1 in vitro, it was found that the strain could induce macrophage to produce ETs structure. The results show that the Tat D of Plasmodium parvum is involved in the process of evading host ETs clearance. The prokaryotic expression of Tat D protein can degrade the host DNA in vitro, which further verifies the hypothesis that Tat D is involved in the mechanism of pathogenicity escape from host, that is, the body releases Tat D protein to extracellular. The DNA skeleton in the ETs structure produced by its deoxyribonuclease activity was used to escape its lethal effects. We evaluated the immune protection of the protein by immunizing the recombinant Pb Tat D and PC Tat D proteins in mice. The results showed that the infection rate of immune group was lower than that of blank group and negative group. And the survival time of the mice was longer. And the results of the serum therapy experiment were consistent with the results of the immune protection test. It is involved in the process of parasite escaping from host innate immunity, and has the potential to be a candidate antigen for intrared vaccine. In this study, we first revealed that Tat D-like DNase protein is associated with Plasmodium plasmodium pathogenicity, and participate in the process of evading NETs clearance. This is of great significance to the understanding of malaria parasite escaping from host innate immunity, and also provides a new idea for the development of malaria vaccine.
【學位授予單位】:吉林大學
【學位級別】:博士
【學位授予年份】:2016
【分類號】:R382.31
【相似文獻】
相關期刊論文 前10條
1 孫翠英,劉迎春,吳勤;強化計劃免疫保護流動兒童健康[J];包頭醫(yī)學;1996年01期
2 李輝,,李榮成,廖蘇蘇,楊進業(yè),曾憲嘉,王樹聲,李艷萍,龔健,潘利,張孔來,農藝;國產乙型肝炎血源疫苗免疫保護持久性及加強免疫[J];中國醫(yī)學科學院學報;1998年01期
3 陽豫,李東至,綜述;母乳的免疫保護機制[J];河南醫(yī)學研究;1999年03期
4 王春鳳,從彥龍;輪狀病毒感染的免疫保護機制[J];中國預防獸醫(yī)學報;2005年05期
5 鄭靈巧;;我國免疫保護范圍擴展迅速專家提示科學規(guī)范嚴格管理[J];中國社區(qū)醫(yī)師(綜合版);2007年11期
6 黃英;輪狀病毒感染的免疫保護機制[J];國外醫(yī)學.病毒學分冊;1997年03期
7 徐勤惠,榮康泰,惲榴紅;河豚毒素的免疫保護試驗[J];中華微生物學和免疫學雜志;2003年02期
8 岳紅云;賀翔鴿;;青光眼視網膜神經節(jié)細胞免疫保護研究進展[J];眼科新進展;2007年10期
9 易勇,鄒全明,程建平,毛旭虎,童文德,曾明,朱永紅,馬穎,王慶旭;Stx2B與IntiminC300融合蛋白的構建、表達及免疫保護研究[J];中華微生物學和免疫學雜志;2005年03期
10 邱振綱;何曉;黃才斌;張明霞;陳心春;;多功能Th1細胞在抗結核免疫保護機制中的作用研究進展[J];臨床肺科雜志;2012年12期
相關會議論文 前8條
1 王春鳳;叢彥龍;;輪狀病毒感染的免疫保護機制[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年
2 王毅超;鄒全明;;幽門螺桿菌能微球疫苗免疫保護實驗及免疫保護機理初探[A];中華醫(yī)學會第七次全國消化病學術會議論文匯編(上冊)[C];2007年
3 田要美;李惠;彭宣憲;;OmpA結構域免疫保護功能研究[A];細胞—生命的基礎——中國細胞生物學學會2013年全國學術大會·武漢論文摘要集[C];2013年
4 彭小紅;陳琳;Claire Gibson;Kimberly Choi;黃復生;王若冰;;藥物減毒瘧原蟲疫苗誘導不同時期特異的免疫保護[A];2013年全國寄生蟲學與熱帶醫(yī)學學術研討會論文集[C];2013年
5 鄭惠;蔡方成;鐘敏;鄧兵;李欣;張曉萍;;空腸彎曲菌多價DNA疫苗的免疫保護效應[A];中華醫(yī)學會第十四次全國兒科學術會議論文匯編[C];2006年
6 石星明;楊桂花;趙妍;張晶;魏秀英;胡順磊;王玫;王云峰;;禽網狀內皮組織增生癥病毒真核表達載體的構建及免疫保護研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會暨中國免疫學會獸醫(yī)免疫分會第八次學術研討會論文集[C];2010年
7 何光志;汪濤;;西氏貝蛔蟲Bs-Ag2抗原基因的克隆以及重組蛋白誘導小鼠的免疫保護試驗(英文)[A];第三屆貴州省自然科學優(yōu)秀學術論文評選獲獎論文集(2010年)[C];2010年
8 朱連德;;豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)變異和疫苗免疫保護[A];中國豬業(yè)發(fā)展大會暨中國畜牧業(yè)協會豬業(yè)分會第二屆會員代表大會論文集[C];2007年
相關重要報紙文章 前3條
1 華南農業(yè)大學 謝青梅 李少璃;接種疫苗萬不能忽略的因素[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年
2 記者 羅臻;春季動物防疫力度大[N];黃石日報;2009年
3 山東省農業(yè)科學院 張秀美研究員;近期禽病動態(tài)及綜合防治[N];中國畜牧報;2005年
相關博士學位論文 前4條
1 常志廣;瘧原蟲TatD-like DNase的功能分析及與蟲體致病性的相關性分析[D];吉林大學;2016年
2 王衡;雞傳染性支氣管炎免疫增強型核酸疫苗的構建與免疫保護機理的研究[D];東北農業(yè)大學;2009年
3 戴迎春;基于P顆粒的諾如病毒GII.4型流行株進化機制及免疫保護研究[D];南方醫(yī)科大學;2013年
4 何光志;八種野生動物蛔蟲的分子鑒定及兩種蛔蟲抗原基因的表達與免疫保護研究[D];四川農業(yè)大學;2009年
相關碩士學位論文 前5條
1 胡雪鶴;胸膜肺炎放線桿菌Lip40蛋白生物學特性研究[D];華中師范大學;2015年
2 湯君;豬胸膜肺炎放線桿菌tbpB基因的克隆、表達及其對小鼠的免疫保護效力研究[D];四川農業(yè)大學;2007年
3 謝懷東;重組IBDV Vp2蛋白的制備與免疫保護試驗[D];南京農業(yè)大學;2012年
4 李俊平;H5亞型禽流感DNA疫苗對鴨和鵪鶉的免疫保護效力研究[D];中國農業(yè)科學院;2011年
5 王平;B群鏈球菌42kD蛋白提取及其免疫學效果的初步探討[D];北京生物制品研究所;2005年
本文編號:1663757
本文鏈接:http://www.sikaile.net/yixuelunwen/jichuyixue/1663757.html