發(fā)布時間：2018-03-18 03:19

  本文選題：微小RNA　切入點：乙肝病毒　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【目的】乙型肝炎病毒(HBV)是一種包膜的DNA病毒,包括較少的完整病毒顆粒以及大量缺少核心蛋白的亞病毒顆粒。HBV基因組是部分雙鏈DNA,基因組3.2 kb,編碼產(chǎn)生四個轉(zhuǎn)錄本,即3.5 kb mRNA,2.4 kb mRNA,2.1 kb mRNA以及0.7 kb mRNA。有四個重疊的開放閱讀框(ORF):S、P、C、X,分別編碼乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)、DNA聚合酶(HBV DNA pol)、核心蛋白(HBc Ag和HBe Ag),以及X蛋白(HBx)。micro RNA(miRNA)是一類長約22 nt的單鏈非編碼RNA,主要通過調(diào)控與之互補的靶基因的表達(dá)發(fā)揮其生物學(xué)功能。越來越多的人和動物的病毒被確定編碼miRNA,病毒miRNA可影響宿主功能以及體內(nèi)一些病毒感染的自然進(jìn)程。然而HBV是否編碼miRNA缺乏實驗依據(jù)以及HBV編碼的非編碼RNA是否影響其在感染過程中的自我復(fù)制仍然是一個值得研究的問題。前期研究中我們利用深度測序在HBV陽性的肝癌組織中獲得了HBV編碼的小非編碼RNA。本課題著重探究HBV編碼的HBV-miR-3對HBV復(fù)制的作用以及其機(jī)制研究。【方法】首先我們通過生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測了HBV-miR-3的二級結(jié)構(gòu),分析其在HBV不同基因型中的保守性。通過Northern blot及RT-q PCR實驗驗證其存在。通過RT-q PCR實驗驗證HBV-miR-3由HBV哪個轉(zhuǎn)錄本編碼,檢測HBV陽性及陰性肝癌組織,HBV陽性及陰性肝細(xì)胞系及非肝細(xì)胞系,HBV感染病人血清中HBV-miR-3的表達(dá)情況。通過Western blot實驗檢測HBV-miR-3的生成是否是經(jīng)典的miRNA生成過程,RNA免疫共沉淀實驗研究HBV-miR-3在RISC-Ago2復(fù)合物中的表達(dá)情況,蔗糖密度梯度離心實驗及RNA免疫共沉淀實驗研究HBV-miR-3是通過何種方式分泌到細(xì)胞胞外。同時,我們通過ELISA實驗研究HBV-miR-3對HBs Ag,HBe Ag分泌的影響,RT-q PCR實驗研究HBV-miR-3對上清HBV DNA水平、HBV完整病毒顆粒,HBV前基因組RNA、總RNA水平的影響,Southern blot實驗檢測HBV-miR-3對HBV復(fù)制中間體的影響,再次我們通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測,并通過Western blot、RT-q PCR以及EGFP熒光報告載體實驗驗證HBV-miR-3的靶基因,并進(jìn)一步研究了靶基因的功能。最后我們通過雙熒光素酶實驗研究HBV-miR-3及靶基因?qū)BV啟動子的影響。【結(jié)果】Northern blot及RT-q PCR實驗確證HBV編碼HBV-miR-3,HBV-miR-3來自乙肝病毒三個轉(zhuǎn)錄本3.5 kb mRNA,2.4 kb mRNA,2.1 kb mRNA。HBV-miR-3存在于HBV陽性的肝癌組織及細(xì)胞系中,HBV急性感染病人血清中HBV-miR-3的表達(dá)量較恢復(fù)期的高。HBV-miR-3的生成是依賴Drosha,Dicer的經(jīng)典的miRNA生成途徑,存在于RISC-Ago2復(fù)合物中,通過外泌體和完整病毒顆粒的方式分泌到細(xì)胞外。HBV-miR-3抑制HBs Ag,HBe Ag分泌,上清HBV DNA水平,完整病毒體的分泌,HBV復(fù)制中間體,HBV前基因組RNA及總RNA的表達(dá)。HBV-miR-3靶定HBV 3.5 kb轉(zhuǎn)錄本,抑制HBV核心蛋白的表達(dá),但不影響HBV DNA聚合酶的表達(dá)。HBV-miR-3通過靶定宿主因子STAT3抑制HBV Enh I/Xp的活性。【結(jié)論】HBV編碼miRNA,即HBV-miR-3。HBV-miR-3通過兩個途徑抑制HBV復(fù)制,一種途徑是通過靶定下調(diào)HBV 3.5 kb轉(zhuǎn)錄本,抑制HBc蛋白的產(chǎn)生,另一種途徑是通過靶定并下調(diào)宿主因子STAT3抑制HBV Enh I/Xp啟動子活性,進(jìn)而抑制HBV復(fù)制轉(zhuǎn)錄。
[Abstract]:[Objective] hepatitis B virus (HBV) is an enveloped DNA virus, including complete virus particles and less subviral particles lack core protein.HBV genome is part of double stranded DNA genome 3.2 KB, encoding four transcripts, 3.5 KB mRNA, 2.4 KB mRNA, 2.1 KB and mRNA 0.7 KB mRNA. has four overlapping open reading frames (ORF): S, P, C, X respectively, encoding hepatitis B virus surface antigen (HBs Ag), DNA polymerase (HBV DNA POL), core protein (HBc Ag and HBe Ag) and X protein (HBx),.Micro RNA (miRNA) is a kind of long chain of about 22 NT encoding RNA, mainly through the expression of target gene regulation and complementary play its biological functions. More and more people and animal viruses were identified encoding miRNA, miRNA virus can affect the host function and the body of some virus infection natural processes. However whether HBV encoding miRNA. The lack of experimental basis and HBV encoding the non RNA encoding effect of the infection in the process of self replication is still a problem worthy of study. In previous research, we use deep sequencing in HBV positive hepatocellular carcinoma received non RNA. encoding HBV encoding this paper focuses on the research of HBV encoding HBV-miR-3 on HBV replication the role and its mechanism study. [Methods] we first through the website of bioinformatics prediction two level structure of HBV-miR-3, analysis of the different genotypes of HBV in Northern blot and RT-q. Through the conservative PCR experiments to verify its existence. Through the RT-q PCR experiment by HBV HBV-miR-3 which transcripts encoding, and detection of HBV positive negative hepatocellular carcinoma, HBV positive and negative liver cells and non liver cells, the expression of HBV-miR-3 in serum of patients with HBV infection by Western blot assay of HBV-miR-3 Whether miRNA is the generation process of the classic RNA, CO immunoprecipitation experiments of HBV-miR-3 expression in the RISC-Ago2 complex, sucrose density gradient centrifugation experiment and RNA immunoprecipitation experiments of HBV-miR-3 is the means by which secreted into the extracellular. At the same time, we through experimental study on HBV-miR-3 HBs ELISA Ag, Ag HBe the supernatant of HBV secretion, DNA level RT-q PCR experimental study of HBV-miR-3, HBV complete virus particles, HBV genomic RNA, total RNA levels, Southern blot assay of HBV-miR-3 effect on HBV replication intermediates, we again through the method of bioinformatics prediction, and by Western blot, RT-q PCR and EGFP fluorescent reporter vector experimental verification of HBV-miR-3 target genes, and further study the target gene function. Finally we by dual luciferase activity assay of HBV-miR-3 and target gene of HBV promoter The influence of. [result] Northern blot and RT-q PCR experiments confirmed HBV encoding HBV-miR-3, HBV-miR-3 from three to 3.5 KB of the hepatitis B virus transcription mRNA, 2.4 KB mRNA, there are liver cancer tissues and cells in the HBV positive in 2.1 KB mRNA.HBV-miR-3,.HBV-miR-3 high expression of HBV-miR-3 generation of serum HBV in a patient with acute infection the recovery period is dependent on Drosha, Dicer classic miRNA generating ways, exist in the RISC-Ago2 complex, the exosomes and the complete virus particles are secreted into the extracellular.HBV-miR-3 mode of inhibition of HBs Ag, HBe Ag HBV DNA level secreted supernatant, secretion of intact virions, HBV replication intermediates, HBV expression of.HBV-miR-3 the target of genomic RNA and total RNA HBV 3.5 KB transcripts, inhibiting the expression of HBV core protein, but does not affect the expression of.HBV-miR-3 HBV DNA polymerase by targeting host factor STAT3 inhibition of HBV Enh I/Xp Activity. [Conclusion] HBV encoding miRNA, HBV-miR-3.HBV-miR-3 through two ways to inhibit the replication of HBV, one way is by targeting the downregulation of HBV 3.5 KB transcripts, inhibit HBc expression, another way is by targeting and down-regulation of host factor STAT3 inhibits HBV Enh I/Xp promoter activity, thereby inhibiting HBV replication transcription.

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R373

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本文編號：1627767