本文選題：高致病性禽流感病毒H5N1　切入點：酵母展示系統(tǒng)　出處：《清華大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：高致病性禽流感病毒H5N1是一種甲型流感病毒。它致病性強,致死率高,能感染包括人在內的多個物種,是當前公共健康面臨的嚴重威脅。深入地了解宿主體內針對流感病毒表面蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)的保護性抗體反應對于研發(fā)高致病性禽流感H5N1的疫苗和抗體藥物都至關重要,因此我們對來自兩位高致病性禽流感H5N1康復者的五株單克隆抗體和兩份血清識別的抗原表位進行了全面的研究。我們首先建立了一種新的分析抗原表位的方法。該方法主要包括構建酵母展示的抗原隨機切割文庫、對文庫進行流式篩選和對分選得到的酵母進行序列分析。我們構建了一個H5N1 HA的抗原文庫,然后用一株識別構象型表位的單克隆抗體和三份HA短肽免疫的小鼠血清對文庫進行了篩選,證明該方法既可以用于分析線性表位,也可以用于分析構象型表位。接著我們還對三份HA重組蛋白免疫的小鼠血清進行了分析,確定了它們主要識別的線性表位,同時也證明該方法可以用于分析復雜的多克隆抗體反應。利用這個方法,我們先對五株單克隆抗體進行了分析,發(fā)現(xiàn)它們識別的表位都位于HA頭部。接著我們又利用酵母表面展示抗原突變文庫進一步確定了五株抗體識別的精細表位,并且還利用點突變假病毒中和實驗確定了其中的關鍵中和位點,證明這五株抗體識別HA頭部三個不同的表位。為了更準確地分析這些抗體識別的表位,我們又根據(jù)這三個不同的表位挑選了三株單克隆抗體并且分別解析了它們與HA頭部的復合物的高分辨率晶體結構。隨后我們對這五株中和抗體和其他已經(jīng)報道的針對H5 HA頭部的中和抗體的表位進行了分析和比較,發(fā)現(xiàn)可以將它們劃分到四個不同的表位區(qū)域。最后我們還對兩份康復者血清識別的表位進行了分析,發(fā)現(xiàn)雖然血清中同時包括針對HA頭部和軀干部的抗體,但是其中的中和抗體主要是針對我們定義的四個表位區(qū)域。綜上所述,我們分析了高致病性禽流感H5N1康復者體內針對HA的單克隆和多克隆抗體識別的表位。這些研究結果不僅能夠解釋人體內針對高致病性禽流感病毒H5N1的抗體中和病毒的機制,還能夠指導這五株單克隆抗體的聯(lián)用和優(yōu)化以及新型流感疫苗的設計。
[Abstract]:Highly pathogenic avian influenza virus H5N1 is a type of influenza A virus. It is highly pathogenic, has a high mortality rate and can infect many species, including human beings. This is a serious threat to public health. A thorough understanding of the protective antibody response of the host to the influenza virus surface protein hemagglutinin (HA) is essential to the development of a highly pathogenic avian influenza H5N1 vaccine and antibody drugs. Therefore, we studied five monoclonal antibodies and two antigenic epitopes recognized by serum from two highly pathogenic avian influenza H5N1 patients. We first developed a new method for the analysis of antigenic epitopes. The method mainly consists of constructing a random cut library of antigens displayed by yeast. We constructed an antigenic library of H5N1 HA by flow screening and sequence analysis of the selected yeast. Then the library was screened with a monoclonal antibody which recognized conformational epitopes and three mouse sera immunized with HA short peptides. It was proved that this method could be used to analyze linear epitopes. It can also be used to analyze conformational epitopes. Then we analyzed three sera of mice immunized with HA recombinant proteins and identified their main linear epitopes. It is also proved that this method can be used to analyze complex polyclonal antibody reactions. It was found that the epitopes they recognized were located on the HA head. Then we further identified five fine epitopes recognized by antibodies using the yeast surface display antigen mutation library. The key neutralization sites were determined by neutralization experiments of point mutant pseudoviruses, which proved that the five antibodies recognize three different epitopes of HA head. In order to analyze the epitopes recognized by these antibodies more accurately, We also selected three monoclonal antibodies based on these three different epitopes and analyzed the high-resolution crystal structures of their complexes with HA head, respectively. The epitopes of neutralizing antibody in the head of H5 HA were analyzed and compared. We found that they could be divided into four different epitope regions. Finally, we analyzed the epitopes recognized by two recovered sera, and found that although the serum included antibodies against both head and trunk cadres of HA, But the neutralizing antibodies are mainly directed at the four epitopes that we define. We have analyzed the epitopes recognized by monoclonal and polyclonal antibodies against HA in highly pathogenic avian influenza H5N1 survivors. These results can not only explain the mechanism of neutralization of human antibodies against highly pathogenic avian influenza virus H5N1. It can also guide the combination and optimization of the five monoclonal antibodies and the design of new influenza vaccines.
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392

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本文編號：1569583