本文關(guān)鍵詞： 阿爾茨海默病 淀粉樣蛋白 蠶蛹 家蠶生物反應(yīng)器 老年斑　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：眾多研究表明,β淀粉樣蛋白(Ap)的沉積導(dǎo)致腦內(nèi)老年斑和淀粉樣血管病的形成是阿爾茨海默癥(AD)發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。老年斑主要由β淀粉樣蛋白Aβ40和Aβ42的聚集而形成,Aβ42是其中最重要的毒性成分。Aβ的主動(dòng)免疫對(duì)不同的AD轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型均有治療作用,而Aβ肽注射疫苗在臨床試驗(yàn)中表現(xiàn)了積極的治療作用但出現(xiàn)了一定比例的副作用。尋找既能高效抑制老年斑的形成,又能消除臨床上不良反應(yīng)的疫苗成了研究的焦點(diǎn)。本研究為了使疫苗具有更溫和的抗原-抗體反應(yīng),采取了Aβ蛋白在家蠶生物反應(yīng)器表達(dá)并制成口服粉劑的方式；為了增強(qiáng)Aβ基因的表達(dá)并降低TH1型免疫反應(yīng)的不良影響,使Aβ肽與霍亂毒素B亞基(CTB)融合表達(dá)；此外保留Aβ肽B細(xì)胞表位同時(shí)減少T細(xì)胞表位也可以降低TH1型免疫反應(yīng)的副作用,因此選擇決定B細(xì)胞表面抗原的Ap15肽作為抗原有可能避免Aβ42全肽免疫的不良反應(yīng)。蠶蛹富含人體所需的各種氨基酸及不飽和脂肪酸,且蠶蛹蛋白本身具有許多生理和藥理活性,可以用作醫(yī)藥中間體。另外,將蠶蛹作為接種載體,具有操作簡(jiǎn)便、回收便捷、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)。本研究嘗試用家蠶生物反應(yīng)器,并運(yùn)用與能夠增強(qiáng)黏膜免疫效果的CTB融合表達(dá)的方式分別生產(chǎn)Aβ42, CTB-AP42和CTB-Aβ15蛋白,并分別用表達(dá)Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白的工程蠶蛹制備蠶蛹凍干粉以更安全的口服的形式免疫阿爾茨海默癥模型小鼠。采用水迷宮、免疫組化、ELISA、圖像分析技術(shù)等手段,從行為、細(xì)胞、分子水平來(lái)評(píng)價(jià)蠶蛹表達(dá)的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15蛋白對(duì)阿爾茨海默癥的防治效果。本研究通過(guò)基因重組技術(shù)將Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15基因克隆入家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pBacPAK8中,并將重組質(zhì)粒pBacPAK8-Aβ42, pBacPAK8-CTB-Aβ42和pBacPAK8-CTB-Aβ15與線(xiàn)性化的家蠶桿狀病毒Bm-BacPAK6的DNA在家蠶BmN細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染,獲得重組家蠶桿狀病毒BmNPV-Aβ42, BmNPV-CTB-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15。用重組家蠶桿狀病毒BmNPV-Aβ42, BmNPV-CTB-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15感染家蠶BmN細(xì)胞和蠶蛹,得到成功表達(dá)；并用BmNPV-Aβ42和BmNPV-CTB-Aβ15感染家蠶五齡幼蟲(chóng),獲得成功表達(dá)。其中,Aβ42蛋白在BmN細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平最高可達(dá)2.2μg/2×106細(xì)胞,五齡幼蟲(chóng)血淋巴中可達(dá)2 μg/mL,蠶蛹中表達(dá)量可達(dá)0.3 μg/g；CTB-Aβ42融合蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)量可達(dá)10 μg/2×106細(xì)胞,蠶蛹中表達(dá)量可達(dá)0.5μg/g; CTB-Aβ15融合蛋白在細(xì)胞中的最大表達(dá)量可達(dá)5μg/2×106細(xì)胞,五齡幼蟲(chóng)血淋巴中可達(dá)0.8μg/mL,而在蠶蛹中的表達(dá)量能夠達(dá)到10μg/g。蠶蛹表達(dá)的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重組蛋白作為口服AD劑型均可誘導(dǎo)AD模型B6C3-Tg小鼠產(chǎn)生抗Ap抗體,與生理鹽水對(duì)照組比較有顯著性差異,其中CTB-Aβ42和CTB-Aβ15免疫組誘導(dǎo)產(chǎn)生Ap抗體的滴度較Aβ42組局(CTB-Aβ42組：1：420,CTB-Aβ15組：1：390,Aβ42組：1：300,對(duì)照組：1：100)。用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的記憶和認(rèn)知能力的水迷宮測(cè)試定位航行實(shí)驗(yàn)中,服用了表達(dá)Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重組蛋白的蠶蛹源口服AD劑型組的小鼠,在第四,第五天的訓(xùn)練中,表現(xiàn)優(yōu)異,潛伏期縮短,其中CTB-Aβ42免疫組和CTB-Aβ15免疫組與服用生理鹽水的對(duì)照組形成顯著性差異。第六天撤掉平臺(tái)的空間搜索實(shí)驗(yàn)中,三個(gè)口服AD劑型組與對(duì)照組相比在曾放置平臺(tái)的目標(biāo)象限停留的時(shí)間都更長(zhǎng),穿越平臺(tái)區(qū)的平均次數(shù)更多(CTB-Aβ42組：2.2,CTB-Aβ15組：1.8,Aβ42組：1.8,對(duì)照組：0.6),CTB-Aβ42免疫組與生理鹽水對(duì)照組差異顯著。對(duì)腦內(nèi)老年斑的免疫組化分析顯示,三個(gè)口服AD劑型免疫組的小鼠與對(duì)照組相比,在腦的前葉,海馬和皮質(zhì)部分都有不同程度的老年斑的減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,對(duì)照組和Aβ42劑型免疫組的小鼠腦內(nèi)的老年斑斑塊較大,而服用表達(dá)CTB-Aβ42和CTB-Aβ15融合蛋白的蠶蛹免疫組的小鼠腦內(nèi)的老年斑斑塊相對(duì)小而分散,在腦內(nèi)所占的相對(duì)面積較小。B6C3-Tg小鼠腦內(nèi)可溶和不可溶的Aβ42肽的含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)服用表達(dá)CTB-Aβ42和CTB-Aβ融合蛋白的蠶蛹免疫組的小鼠腦內(nèi)無(wú)論是可溶和不可溶的Aβ42肽都顯著低于對(duì)照組小鼠。綜合評(píng)價(jià)提示,蠶蛹表達(dá)的Aβ42, CTB-Aβ42和CTB-Aβ15重組蛋白作為口服制劑在AD模型小鼠上具有明顯改善AD小鼠的阿爾茨海默病病癥,有望開(kāi)發(fā)為AD口服疫苗。
[Abstract]:In order to improve the expression of A尾42 , CTB - AP42 and CTB - A尾15 protein and to reduce the adverse effects of TH1 - type immune response , it is suggested that the expression of A尾42 , CTB - A尾42 and CTB - A尾15 protein can be used as an intermediate . The results showed that the expression of CTB - A尾42 , CTB - A尾42 and CTB - A尾15 recombinant protein could induce the AD model of AD model . The titers of CTB - A尾42 and CTB - A尾15 immune groups were higher than those in normal saline control group ( CTB - A尾42 group : 1 : 390 , A尾42 group : 1 : 300 , control group : 1 : 100 ) . The results showed that both soluble and insoluble A尾42 and CTB - A尾42 and CTB - A尾15 were significantly lower in the brain than in the control group . The results showed that both soluble and insoluble A尾42 and CTB - A尾42 were significantly lower in the brain .

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R749.16;R-332

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本文編號(hào)：1526927