本文關鍵詞： 結核分枝桿菌 Lip家族蛋白 脂肪酶 LipL　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學院》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：結核病是一種由結核分枝桿菌引起的一種慢性消耗性傳染病。全世界每年新增近千萬感染者,造成百萬人死亡。我國是世界上結核病發(fā)病率最高的22個國家之一,結核病患病人數(shù)僅次于印度,位居第二。近年來,由于多重耐藥結核菌株、廣泛耐藥結核菌株以及HIV合并感染等問題的出現(xiàn),使結核病的防控工作面臨更嚴峻的挑戰(zhàn)。結核分枝桿菌細胞壁結構復雜,含有大量的脂類成分。結核分枝桿菌基因組中有250個基因編碼假定的酶類參與了脂質(zhì)的合成或分解,表明這些酶類在其生命周期或其致病中發(fā)揮著重要作用。本研究以結核分枝桿菌中Lip家族為研究對象,旨在挖掘出具有脂肪酶功能的蛋白,系統(tǒng)地分析酶的活性特征,鑒定出活性中心位點,分析其免疫原性,探究其在致病方面發(fā)揮的作用,從而為疫苗和新藥的研發(fā)提供有價值的新思路。本研究首先克隆了結核分枝桿菌H37Rv基因組中l(wèi)ip家族的14個基因,在大腸桿菌中進行表達,但所有表達蛋白在各種誘導條件下都形成了包涵體,且所有復性產(chǎn)物檢測不到脂肪酶活性。考慮到包涵體的形式下蛋白已完全失去活性,而復性效果難以評價,因而換用恥垢分枝桿菌表達系統(tǒng)進行表達。在穿梭載體pMV261的基礎上,首先構建了乙酰胺誘導型表達載體,然后將以上14個基因在恥垢分枝桿菌表達系統(tǒng)中誘導表達,共有10個重組蛋白以可溶形式表達。通過對這些表達蛋白脂肪酶活性的初步篩選,發(fā)現(xiàn)Lip L蛋白較其他9個蛋白對長碳鏈脂肪具有更高的水解活性。Lip L的底物特異性結果顯示,它不僅可以水解短碳鏈脂肪底物,對長碳鏈的脂肪底物也有很高的水解活性。因此,LipL屬于水解非水溶性脂肪的脂肪酶,且其酶活性的發(fā)揮不需要金屬離子的輔助。LipL脂肪酶活性的最適溫度是37°C,最適pH為8.0,這兩個特點都體現(xiàn)了結核分枝桿菌對其生存環(huán)境—宿主細胞微環(huán)境的適應能力。在明確LipL蛋白的脂肪酶活性后,我們基于生物信息學預測其與脂肪酶活性相關的基序可能為G359-X-S-X-G363、S88-X-X-K91或G49-G-G51。利用點突變實驗對此預測進行驗證,發(fā)現(xiàn)三個基序中G50、S88和K91三個氨基酸殘基位點的突變均導致LipL的脂肪酶活性降低了90%。該結果表明脂肪酶的活性與S88-X-X-K91和G49-G-G51這兩個基序是相關的,其中G50、S88和K91是活性中心的關鍵氨基酸殘基。此外,我們進一步對Lip L蛋白進行3D結構建模,以觀察其活性相關基序及關鍵氨基酸殘基的空間位置。模擬結果顯示,Lip L蛋白的二級結構由多個α螺旋和β折疊二級結構組成,這個結構符合α/β水解酶家族的特征。同時,LipL蛋白的結構表面圖顯示,G49-G-G51基序在蛋白表面形成了一個pocket結構,pocket結構易于與底物相結合,這與G49-G-G51基序是LipL蛋白脂肪酶活性中心且G50氨基酸殘基是活性中心的關鍵氨基酸相符。利用同源建模,分析了lipL蛋白拓撲學的結構,進一步驗證了在點突變實驗中獲得的有關酶活性中心位點結果。眾所周知,菌體表面蛋白不僅對病原菌的致病性至關重要,通常也是重要的免疫原。通過差速離心分離分枝桿菌的各個亞細胞組分,利用Western blot技術證實了Lip L蛋白定位于分枝桿菌的細胞膜和細胞壁。該蛋白的亞細胞定位暗示其可能在分枝桿菌致病過程中起到了作用,也可能為重要的免疫原。用ELISA檢測LipL蛋白與結核陽性血清的反應,結果顯示結核病病人的血清中存在能與Lip L蛋白發(fā)生反應的抗體。表明LipL蛋白在結核病人感染期內(nèi)有表達,并且引起了強烈的體液免疫應答。將LipL的蛋白純化產(chǎn)物免疫BALB/c小鼠,結果表明LipL蛋白可誘導產(chǎn)生強烈的體液免疫應答,并能激活CD8+介導的T細胞免疫應答。以上結果證明LipL蛋白是分枝桿菌的一種重要免疫原。同時,將超表達LipL的恥垢分枝桿菌重組菌感染小鼠,與空載體重組菌對照組相比,Ms/LipL重組菌在小鼠肺部的定殖能力更強,表明Lip L蛋白可能與結核分枝桿菌的致病性有一定關系。綜上,本研究克隆表達了結核分枝桿菌lip家族的14個基因,構建了分枝桿菌系統(tǒng)乙酰胺誘導表達載體,利用該表達系統(tǒng)鑒定出一個高活性脂肪酶LipL;詳細分析了LipL蛋白的脂肪酶酶活性特征,通過點突變及同源建模證實了酶的活性中心G49-G-G51結構域;確認了Lip L蛋白在分枝桿菌中定位于細胞壁細胞膜;證實Lip L具有較好的免疫原性,能激起體液免疫和細胞免疫反應,并在分枝桿菌的致病過程中發(fā)揮了一定作用。
[Abstract]:In this study , we cloned 14 genes of lip family in Mycobacterium tuberculosis H37Rv genome and expressed in E . coli . The results showed that it could not only hydrolyze short carbon chain fat substrate , but also could not only hydrolyze short carbon chain fat substrate , but also could not only hydrolyze short carbon chain fat substrate . The results showed that LipL protein could induce a strong humoral immune response and activate CD8 + mediated T cell immune response . The results showed that LipL protein could induce strong humoral immune response and activate CD8 + mediated T cell immune response .

【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R378.911

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本文編號：1504430