本文關鍵詞：抑制PGC-1α的表達對PD模型小鼠炎癥反應的影響　出處：《河北師范大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 帕金森病 PGC-1α 慢病毒 多巴胺能神經(jīng)元 膠質(zhì)細胞 炎癥反應 MPTP C57BL/6小鼠

【摘要】：帕金森病(PD)是繼阿爾茨海默病之后的第二種最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,也是中老年中發(fā)病率較高的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。PD的主要特征表現(xiàn)為運動遲緩、僵硬、震顫和姿勢不穩(wěn)定性。雖然這些癥狀已經(jīng)是PD的經(jīng)典描述,但最近其被公認為是一個更加復雜的疾病,包括運動癥狀和非運動癥狀(NMS),如抑郁癥、睡眠障礙、感覺異常、植物神經(jīng)功能紊亂和認知能力的下降。研究發(fā)現(xiàn),與PD發(fā)生密切的因素主要有線粒體功能障礙、氧化應激、α-突觸核蛋白基因突變等遺傳因素、環(huán)境因素、炎癥反應等,但具體發(fā)病機制尚不完全清楚。在上述眾多因素中,線粒體功能障礙和氧化應激反應是引發(fā)PD的主要因素。線粒體是生命個體中直接提供能量的細胞器,其在維持神經(jīng)元正常功能上起到非常重要的作用。線粒體復合物Ⅰ(mitochondrial complexⅠ)是線粒體呼吸鏈中最大的復合體,是線粒體發(fā)揮氧化磷酸化功能的關鍵。其異�？梢砸鸹钚匝踝杂苫�(reactive oxygen species,ROS)生成增多,從而引發(fā)細胞損傷,乃至死亡。除此之外,膠質(zhì)細胞誘發(fā)的炎癥反應對PD的影響逐漸成為研究的熱點。在正常情況下,膠質(zhì)細胞處于靜息狀態(tài)。當神經(jīng)元損傷導致免疫原性分子釋放時,膠質(zhì)細胞呈現(xiàn)變形形態(tài),并顯示出相應的活化表型。神經(jīng)炎癥最顯著的特點是小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的激活與增生。膠質(zhì)細胞的激活可以產(chǎn)生大量有害的活性氧(ROS)和活性氮(RNS),與此同時,還可以分泌大量促炎細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和干擾素γ(IFN-γ),結合神經(jīng)元受體從而啟動細胞的死亡途徑。近年來,有多種生理功能活性的過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的共激活因子1α(PGC-1α)受到越來越多的關注。其功能除了對線粒體的生物發(fā)生及代謝過程起到非常重要的作用外,還發(fā)現(xiàn)PGC-1α有抑制炎癥反應的作用,其機制可能是通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路來抑制膠質(zhì)細胞的激活與增生而抑制炎癥反應的過程,從而對神經(jīng)元起到保護作用。但在PD發(fā)生過程中,PGC-1α起到何種作用?其表達的變化與炎癥反應和PD發(fā)生之間是何種關系?這是一個值得深入探討的問題。本研究擬通過降低PGC-1α的表達,觀察其表達情況與炎癥反應之間關系、是否對神經(jīng)元起到保護作用、以及是否可以改善PD小鼠的癥狀等對上述問題進行探討。本研究以C57BL/6小鼠為對象,用立體定位注射方法將構建的抑制PGC-1α表達的慢病毒載體注射至小鼠的一側黑質(zhì),飼養(yǎng)28 d后,再通過腹腔注射MPTP的方法復制PD小鼠亞急性模型。實驗分為空白對照組(立體定位saline,腹腔注射saline,記為saline+saline組)、實驗對照組(立體定位saline,腹腔注射MPTP 30 mg/kg,記為MPTP+saline組)、實驗空載組(立體定位空載慢病毒載體NCKD,腹腔注射MPTP,記為MPTP+NCKD組)、實驗組(立體定位抑制PGC-1α表達的慢病毒載體,腹腔注射MPTP,記為MPTP+KD組)。采用行為學方法檢測帕金森癥狀;免疫熒光染色方法檢測黑質(zhì)內(nèi)TH、PGC-1α等陽性細胞,以及小膠質(zhì)細胞的標記物Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)的數(shù)量和星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP(Glial Fiber Acid Protein,GFAP)的累積光密度;FJC染色法檢測凋亡細胞的數(shù)量;Western blot技術檢測TH、PGC-1α蛋白在黑質(zhì)內(nèi)的表達情況,以探究抑制PGC-1α的表達對PD小鼠行為癥狀,以及炎癥反應相關的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的增殖情況的影響,揭示PGC-1α、炎癥和PD之間的關系。所得實驗結果如下:1.用腹腔注射MPTP(30 mg/kg)的方法成功復制出PD小鼠模型。并隨著MPTP注射天數(shù)的增加,存活的多巴胺能神經(jīng)元、PGC-1α陽性細胞逐漸減少,凋亡細胞數(shù)逐漸增加;TH、PGC-1α蛋白表達量越來越少;炎癥反應越來越重,最終確定MPTP最佳損傷時間窗為3 d。2.成功構建了抑制PGC-1α表達的慢病毒載體,用q PCR方法檢測出最佳干擾靶點,通過熒光法測定出病毒的最佳滴度為5×108 TU/ml。3.MPTP+KD組黑質(zhì)DA能神經(jīng)元數(shù)量較MPTP+saline組顯著減少(P0.05);MPTP+KD組小鼠自主活動及站立次數(shù)較MPTP+saline組呈下降趨勢,而轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)以及游泳停頓時間較MPTP+saline組呈遞增趨勢,但均無統(tǒng)計學差異。4.MPTP+KD組黑質(zhì)PGC-1α陽性細胞數(shù)較MPTP+saline組顯著減少(P0.05),這表明立體定位注射抑制PGC-1α表達的慢病毒載體起到了減少PGC-1α表達的作用。5.定位注射抑制PGC-1α表達的慢病毒載體后,MPTP+KD組黑質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞的表達量較MPTP+saline組顯著降低(P0.05)。提示炎癥反應降低。通過上述結果的分析,得出如下結論:1.通過炎癥與DA神經(jīng)元的存活與凋亡確定了MPTP最佳損傷時間窗為3 d。2.篩選出抑制PGC-1α表達的慢病毒載體,病毒滴度為5×108 TU/ml。3.抑制PGC-1α的表達,顯著減少黑質(zhì)DA能神經(jīng)元存活數(shù)量、增多其凋亡,同時也降低小膠質(zhì)細胞以及星形膠質(zhì)細胞的激活程度。上述結果表明,抑制PGC-1α的表達,可通過影響小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的活性而降低炎癥反應。本研究為防治帕金森氏病提供了基礎資料,但相關的機制還有待于后繼的進一步研究。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5;R-332

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本文編號：1430916