本文關鍵詞：TLRs信號通路和Treg在H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保護中的作用　出處：《南昌大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景和目的:目前在對H.pylori與機體免疫反應關系及H.pylori疫苗機制的研究多集中在獲得性特異性免疫反應,對固有免疫反應在從中所起的作用很少研究,而只有同時研究H.pylori感染和疫苗所誘導的固有免疫反應和獲得性免疫反應才能真正闡明H.pylori免疫致病和疫苗免疫保護的機制。Toll樣受體(Tol1 1ike receptors,TLRs)是一類與固有免疫密切相關,識別病原體相關分子模式(PAMPs)的膜蛋白分子。TLRs信號通路可通過不同機制參與病原體的免疫致病和疫苗的免疫保護作用。調(diào)節(jié)性T細胞(Regulatory T-Cells,Treg)是具有調(diào)節(jié)功能的T細胞群體,其具有免疫抑制作用。CD4+CD25+Treg是Treg中最為重要的亞型,是免疫抑制機制中的關鍵成分。TLRs信號通路與Treg可相互影響,TLRs信號通路可抵抗Treg引起的免疫抑制,還可通過My D88依賴途徑調(diào)節(jié)Treg的功能。反之,Treg也可降低TLRs刺激的細胞因子的產(chǎn)生。TLRs與Treg相互作用與影響,共同維持著機體免疫系統(tǒng)的平衡。但在H.pylori感染和H.pylori疫苗免疫時TLRs信號通路與Treg之間的相互作用與影響,及它們與H.pylori逃避宿主免疫清除和疫苗免疫保護作用的關系目前尚不清楚。為此,本文研究了H.pylori感染和不同佐劑的H.pylori疫苗接種后小鼠胃腸道局部TLRs信號通路和Treg的變化及其相互關系。從這一新的角度探討H.pylori逃避宿主免疫清除和H.pylori疫苗的免疫保護機制。方法:1、H.pylori全菌蛋白抗原殼聚糖微球的制備及體外釋放特性研究采用Berthold沉淀法制備殼聚糖微球,并根據(jù)不同的殼聚糖、不同的沉淀劑、不同冰乙酸濃度、不同p H值和是否進行超聲處理來優(yōu)化殼聚糖微球制備條件;使用掃描電鏡及粒徑分析儀觀察殼聚糖微球的形態(tài)及粒徑分布;以不同量比的微球與抗原,進行殼聚糖微球包裹H.pylori全菌蛋白抗原;采用BCA蛋白定量法測量分析微球的抗原包裹率、包裹量及釋放率。2、TLRs信號通路和Treg在H.pylori感染和疫苗免疫保護中的作用的研究(1)TLRs信號通路和Treg在疫苗免疫保護中的作用的研究:6~8周齡的SPF級BALB/C小鼠隨機分為以下9組:(1)空白對照組:PBS溶液;(2)TLR4單抗+空白對照組;(3)CD25單抗+空白對照組;(4)H.pylori抗原+CT;(5)TLR4單抗+H.pylori抗原+CT;(6)CD25單抗+H.pylori抗原+CT;(7)殼聚糖微球-H.pylori抗原;(8)TLR4單抗+殼聚糖微球-H.pylori抗原;(9)CD25單抗+殼聚糖微球-H.pylori抗原;各組于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,免疫后4周后4組小鼠給予1×109活菌/ml的SS1 H.pylori菌液0.5ml/只進行攻擊,隔日一次,共4次。末次攻擊后4周,處死小鼠,取標本待測。(2)TLRs信號通路和Treg在H.pylori感染中的作用的研究:6~8周齡的SPF級BALB/C小鼠隨機分為以下3組:(1)直接建立H.pylori感染模型;(2)TLR4單抗預處理后建立H.pylori感染模型;(3)CD25單抗預處理后建立H.pylori感染模型。模型的建立:給予含109/ml的SS1 H.pylori菌液,0.5ml/只灌胃,隔日1次,共5次。末次灌胃12周后,處死小鼠,取標本待測。(3)各項指標檢測:(1)胃黏膜內(nèi)H.pylori的檢測:采用改良Giemsa染色檢測;(2)胃黏膜炎癥程度檢測:采用HE染色,并按Sakagami法評分;(3)胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3蛋白檢測:采用免疫組織化學染色法及Western blot檢測;(4)胃黏膜內(nèi)細胞因子IFN、IL-12、IL-17、IL-4、IL-10含量的檢測:采用雙抗體夾心ELISA法;(5)血清抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a及唾液中抗H.pylori Ig A含量的檢測:采用間接ELISA法檢測。結(jié)果:1、H.pylori全菌蛋白抗原殼聚糖微球的制備及體外釋放特性研究從32種殼聚糖微球制備方案中篩選出了以海得貝殼聚糖為原料、冰乙酸的濃度為1%、硫酸鈉為沉淀劑、p H值為5.0、不進行超聲處理的最佳制備方案;經(jīng)掃描電鏡(SEM)示微球光滑圓整、致密,粒徑分布在1.0-5.0μm;抗原與微球的量比為1:5時包裹率最大,包裹時間為3h時包裹率可達最大,抗原包裹率為79.92%,包裹量為16.47%;體外釋放實驗表明,總抗原釋放率為20.39%,呈緩慢釋放狀態(tài)。2、TLRs信號通路和Treg在H.pylori感染和疫苗免疫保護中的作用的研究(1)兩種佐劑的H.pylori疫苗組TLR4阻斷小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),未予TLR4阻斷的疫苗組的定植密度顯著低于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠的H.pylori定植密度無差別(P0.05)。(2)H.pylori活菌接種后胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),未予TLR4阻斷的感染組的定植密度顯著低于TLR4阻斷的感染組(P0.05)。(3)兩種佐劑的H.pylori疫苗組未予CD25阻斷的H.pylori定植密度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),CD25阻斷的疫苗組的定植密度顯著低于未予CD25阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠的H.pylori定植密度無差別(P0.05)。(4)H.pylori活菌接種后胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),CD25阻斷的感染組H.pylori定植密度顯著低于未予CD25阻斷的感染組(P0.05)。(5)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃粘膜炎癥程度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜炎癥程度顯著低于未予TLR4阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠的胃粘膜炎癥程度無差別(P0.05)。(6)H.pylori活菌接種后胃黏膜的炎癥程度顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),TLR4阻斷的感染組胃黏膜的炎癥程度顯著低于未予TLR4阻斷的感染組(P0.05)。(7)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜炎癥程度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),CD25阻斷的疫苗組胃黏膜的炎癥程度顯著高于未予CD25阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜炎癥程度無差別(P0.05)。(8)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜炎癥程度顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),CD25阻斷的感染組胃黏膜的炎癥程度顯著高于未予CD25阻斷的感染組(P0.05)。(9)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01-0.001),未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達顯著高于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05),免疫組化法測得未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達顯著低于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05),Western blot測得未予TLR4阻斷的疫苗組與TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達無明顯差異(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達無差別(P0.05)。(10)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),未予TLR4阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達顯著高于TLR4阻斷的感染組(P0.05),未予TLR4阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達顯著低于TLR4阻斷的感染組(P0.05)。(11)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),未予CD25阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達顯著低于CD25阻斷的疫苗組(P0.05),未予CD25阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達顯著高于CD25阻斷的疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達無差別(P0.05)。(12)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65、Foxp3表達顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01-0.001),未予CD25阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)My D88、NF-κB p65表達顯著低于CD25阻斷的感染組(P0.05),未予CD25阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)Foxp3表達顯著高于CD25阻斷的感染組(P0.05)。(13)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),以CT為佐劑組無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子IL-4、IL-10含量顯著低于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),以殼聚糖微球為佐劑組無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-4含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)IL-10含量顯著高于未阻斷的空白對照組(P0.05),與TLR4阻斷的空白對照組無明顯差別(P0.05),未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)IL-10含量與TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組無明顯差別(P0.05)。未予TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷的疫苗組(P0.05),未予TLR4阻斷的疫苗組與TLR4阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子IL-4、IL-10含量無明顯差異(P0.05)。TLR4阻斷以殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)IFN、IL-12、IL-17含量無差異(P0.05),TLR4阻斷以CT為佐劑組胃黏膜內(nèi)IFN含量顯著高于以殼聚糖微球為佐劑組(P0.05),IL-12、IL-17含量無差異(P0.05)。(14)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子IL-4、IL-10含量顯著低于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01)。未予TLR4阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子IFN、IL-12、IL-17含量顯著高于TLR4阻斷的感染組(P0.05-0.001),TLR4阻斷與未阻斷組胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子IL-4、IL-10含量無明顯差異(P0.05)。(15)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),以CT為佐劑組無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子含量顯著低于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05-0.001),以殼聚糖微球為佐劑組無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-4含量顯著低于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),而胃黏膜內(nèi)IL-10含量無明顯差異(P0.05)。未予CD25阻斷的疫苗組胃黏膜內(nèi)IFN、IL-17含量顯著低于CD25阻斷的疫苗組(P0.05),以殼聚糖微球為佐劑組未予CD25阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-12含量顯著低于CD25阻斷的(P0.05),而以CT為佐劑組中兩者胃黏膜內(nèi)IL-12含量無明顯差別(P0.05)。疫苗組CD25阻斷與未阻斷的胃黏膜內(nèi)IL-4含量無明顯差異(P0.05),未阻斷的疫苗組的胃黏膜內(nèi)IL-10含量顯著高于CD25阻斷的疫苗組(P0.05-0.01)。CD25阻斷以CT和殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)IL-12、IL-17含量無差異(P0.05),CD25阻斷以CT為佐劑組胃黏膜內(nèi)IFN含量顯著高于以殼聚糖微球為佐劑組(P0.05)。CD25阻斷以殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子含量顯著高于以CT為佐劑組(P0.05)。(16)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子含量顯著低于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01-0.001)。未予CD25阻斷的感染組胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子含量顯著低于CD25阻斷的感染組(P0.05-0.001),未阻斷感染組胃黏膜內(nèi)IL-10含量顯著高于阻斷感染組(P0.05),而兩者胃黏膜內(nèi)IL-4含量無明顯差異(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠胃黏膜內(nèi)TH1和TH17細胞因子含量無差別(P0.05)。以殼聚糖微球為佐劑組胃黏膜內(nèi)TH2細胞因子含量顯著高于以CT為佐劑組(P0.05)。(17)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或未阻斷的抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),TLR4阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無明顯差異(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無差別(P0.05)。(18)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或未阻斷的血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),感染組TLR4阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無明顯差異(P0.05)。(19)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或未阻斷的血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),疫苗組CD25阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G含量無明顯差異(P0.05),CD25阻斷疫苗組Ig G1、Ig G2a含量顯著高于未阻斷疫苗組(P0.05-0.001)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量無差別(P0.05)。(20)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或未阻斷的抗H.pylori Ig G、Ig G1、Ig G2a含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),感染組CD25阻斷與未阻斷組血清中抗H.pylori Ig G、Ig G1含量無明顯差異(P0.05),CD25阻斷感染組Ig G2a含量顯著高于未阻斷感染組(P0.05)。(21)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是TLR4阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.05),TLR4阻斷疫苗組唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著高于未阻斷疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠抗H.pylori Ig A含量無差別(P0.05)。(22)H.pylori活菌接種后無論是TLR4阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于TLR4阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),TLR4阻斷感染組唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著低于未阻斷感染組(P0.05)。(23)兩種佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠無論是CD25阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.001),以CT為佐劑疫苗組CD25阻斷的唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著高于未阻斷疫苗組(P0.01),以殼聚糖微球為佐劑疫苗組CD25阻斷的唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著低于未阻斷疫苗組(P0.05)。不同佐劑的H.pylori疫苗接種小鼠抗H.pylori Ig A含量無差別(P0.05)。(24)H.pylori活菌接種后無論是CD25阻斷或是未阻斷組抗H.pylori Ig A含量顯著高于CD25阻斷和未阻斷的空白對照組(P0.01),CD25阻斷感染組唾液中抗H.pylori Ig A含量顯著低于未阻斷感染組(P0.05)。結(jié)論:1、本研究篩選的殼聚糖微球制備條件所制備的殼聚糖微球?qū).pylori全菌蛋白抗原具有較高的包裹率和較好的控釋效果。2、TLR4阻斷可降低H.pylori疫苗的免疫保護率,增加H.pylori自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度;而CD25阻斷可增加H.pylori疫苗的免疫保護率,降低H.pylori自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度。3、TLR4阻斷可減輕H.pylori疫苗接種小鼠和H.pylori感染小鼠胃黏膜炎癥程度;而CD25阻斷可加劇H.pylori疫苗接種小鼠和H.pylori感染小鼠胃黏膜炎癥程度。4、TLR4阻斷可下調(diào)My D88的表達和抑制NF-κB活化,增加CD4+CD25+Foxp3+Treg的數(shù)量,CD25阻斷可上調(diào)My D88的表達和促進NF-κB活化,降低CD4+CD25+Foxp3+Treg的數(shù)量,這可能是它增強H.pylori疫苗的免疫保護作用、降低H.pylori自然感染小鼠胃黏膜內(nèi)H.pylori定植密度的機制。5、TLR4阻斷可降低TH1及TH17細胞因子水平,但對TH2細胞因子無影響,CD25阻斷可增加TH1及TH17細胞因子水平,降低TH2細胞因子。6、TLR4及CD25阻斷對血清中抗H.pylori Ig G無影響,CD25阻斷可增加血清中抗H.pylori Ig G1、Ig G2a水平。7、TLR4阻斷可增加唾液中抗H.pylori Ig A含量水平,CD25阻斷可降低唾液中抗H.pylori Ig A含量水平。8、以殼聚糖微球為佐劑的H.pylori疫苗與傳統(tǒng)的佐劑CT為佐劑的H.pylori疫苗對H.pylori感染具有同樣的免疫保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392
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本文編號：1424865