本文關鍵詞：TREM-1對大腸桿菌或雙鏈RNA誘導巨噬細胞活化的調控作用及分子機制　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：致病原感染機體后,其本身固有的特殊成分——病原體相關分子模式(pathogenassociated molecular patterns,PAMPs)能夠被機體先天免疫細胞的模式識別受體(pattern-recognition receptors,PRRs)識別,一方面啟動病原的吞噬、清除和殺傷,一方面激活機體炎癥反應。而由嚴重感染所致失控性炎癥反應是引發(fā)感染患者多器官功能損傷、甚至衰竭的重要原因。由于其病死率高,目前還缺乏十分有效的防治手段。新近的研究證實表達于髓樣細胞的TREM-1(triggering receptors expressed on myeloid cells-1,TREM-1)在先天免疫系統(tǒng)中具有重要調控作用。該受體活化能夠顯著上調革蘭陰性細菌/LPS作用于多形核白細胞后多種促炎癥細胞因子的產生,顯著放大感染相關炎癥信號,在感染所致膿毒癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,故極有可能是抗膿毒癥治療研究的重要靶分子。而革蘭陰性細菌通過其表面的LPS作用于TLR4(Toll-like receptor 4)/MD-2(Myeloid differentiation protein-2)受體復合體觸發(fā)的炎癥信號的過度放大是內毒素血癥的發(fā)生發(fā)展基礎,但以此為靶分子抑制LPS觸發(fā)放大的炎癥信號治療內毒素血癥動物模型并不一定能取得良好的療效。其原因可能是干預TLR4/MD-2受體復合體的功能對先天免疫系統(tǒng)內化、殺傷、清除革蘭陰性細菌和LPS影響甚巨,導致嚴重的副作用。TREM-1受體雖然對炎癥信號的級聯放大具有重要調控作用,但該受體是否對于先天免疫系統(tǒng)識別、吞噬、殺傷、清除革蘭陰性細菌/LPS有作用以及作用的大小尚沒有完全認識清楚。鑒于此,本研究通過基因工程方法構建表達EGFP的大腸桿菌,以此為工具研究證實了TREM-1活化對小鼠巨噬細胞內化及細胞內殺傷大腸桿菌具有促進作用。由于TREM-1為髓樣細胞表面的一種膜受體,本身缺乏識別LPS/大腸桿菌的分子結構,故直接參與巨噬細胞內化大腸桿菌過程的可能性不大。為深入探討可能機制,本研究通過構建慢病毒并感染RAW264.7細胞獲得差異表達TREM-1的細胞株,并運用基因芯片技術比較了差異表達TREM-1的細胞株之間的全基因組表達譜差異,以期探討差異表達TREM-1對內化大腸桿菌關鍵受體或信號分子的影響。在構建差異表達TREM-1細胞株的過程中,我們發(fā)現了一個新的現象。即對照慢病毒感染的細胞株,TREM-1表達顯著升高。而已知慢病毒的感染過程為所謂的“自殺式感染”,感染后可將靶序列整合到宿主細胞基因組,但并不會復制包裝產生新的病毒。而整合到宿主基因組的序列可不斷轉錄產生新的ds RNA。這說明對照慢病毒產生的外源性亂序ds RNA可以誘導TREM-1表達上調。而ds RNA是雙鏈RNA病毒最主要的PAMPs之一,機體的免疫細胞則是通過其PRRs識別胞漿或內體中的ds RNA,進而分泌Ⅰ型干擾素和炎癥介質,產生抗病毒免疫,并產生炎癥反應。盡管已有多項研究證實TREM-1受體參與調控了機體先天免疫系統(tǒng)對革蘭陽性細菌、真菌及病毒產生的多種PAMPs的識別及后續(xù)信號過程,但TREM-1受體是否在機體先天免疫系統(tǒng)識別ds RNA后產生的抗病毒免疫中發(fā)揮調節(jié)作用還缺乏深入的認識。故本研究證實外源性ds RNA能夠上調TREM-1的表達,且TREM-1活化可能正向調控ds RNA誘導的抗病毒免疫,而TREM-1的這種調節(jié)效應與該受體活化能夠上調MAPK信號通路活性及病毒感染相關的PRRs表達有關。主要的實驗方法和結果:1.分別用經2%血清調理素化的和未經調理的大腸桿菌BL21(DE3)plys S感染BMDMs,12hrs后收集細胞培養(yǎng)上清,ELISA法檢測上清中TNF-α和IL-6的濃度。結果發(fā)現感染經血清調理或未調理的大腸桿菌的細胞培養(yǎng)上清中,TNF-α和IL-6的分泌均明顯上調(P0.01);而用TREM-1激動型抗體活化該受體后再感染細菌,則TNF-α和IL-6的分泌效應被顯著放大(P0.05);而單獨比較調理素化和未調理細菌對巨噬細胞的刺激作用,則發(fā)現調理素化細菌對TNF-α和IL-6的分泌具有更強的誘導作用(P0.05)。2.通過基因工程方法構建EGFP原核表達載體,轉化入表達大腸桿菌后,通過誘導EGFP表達使細菌攜帶穩(wěn)定綠色熒光,從而獲得能夠可視化研究吞噬細胞內化細菌過程及通過流式細胞術定量、高通量測定吞噬細胞內化能力的有力工具。3.使用TREM-1受體激動型抗體與BMDMs孵育半小時活化該受體,加入細菌感染細胞半小時,可檢測到TREM-1受體活化的細胞內化有細菌的比例顯著增加,細胞平均熒光強度顯著增加,吞噬系數增高(P0.01)。在不同時像點收集保本檢測結果也證實TREM-1活化促進BMDMs對大腸桿菌的吞噬。同時,也采用同樣方法檢測RAW264.7細胞內化大腸桿菌的能力,結果發(fā)現RAW264.7細胞內化大腸桿菌的能力弱于BMDMs,且TREM-1受體活化不能顯著上調RAW264.7細胞內化大腸桿菌能力。4.用TREM-1受體激動型抗體與巨噬細胞孵育半小時后,向細胞培養(yǎng)上清中加入熒光標記乳膠微球和中性紅顆粒,結果發(fā)現細胞非特異胞飲能力并未增強,而作為實驗對照的經LPS刺激半小時的BMDMs的胞飲能力顯著增強(P0.01)。5.同樣激活BMDMs的TREM-1受體,并使其內化大腸桿菌。然后用抗生素殺滅胞外菌后,再繼續(xù)培養(yǎng)細胞5hrs進行細胞內殺傷大腸桿菌,通過裂解細胞進行菌落計數發(fā)現TREM-1受體活化的BMDMs的細胞內殺傷大腸桿菌的能力顯著增強(P0.05)。6.慢病毒感染RAW264.7細胞,對照慢病毒感染組細胞的TREM-1表達上調,而敲減TREM-1表達并不影響TLR4、MD-2表達。TREM-1受體活化增強巨噬細胞內化革蘭陰性細菌,可能與該受體活化調節(jié)TLR4受體功能及MAPK等信號通路有關。7.Poly IC刺激RAW264.7細胞,可劑量依賴地上調TREM-1的表達(P0.001),這一效應可被PI3K、MAPK信號通路抑制劑阻斷(P0.01)。Poly IC刺激BMDMs可持續(xù)上調TREM-1表達,在刺激后36hrs達到高峰,而LPS誘導的TREM-1表達上調在24hrs即達到高峰,隨后下跌。短片段ds RNA對TREM-1表達同樣具有誘導作用。8.細胞與激動型anti-TREM-1抗體孵育活化TREM-1,再經Poly IC刺激后,其MAPK信號通路的JNK、ERK1/2和P38的磷酸化發(fā)生更早,磷酸化水平更高,而且持續(xù)時間更長,MAPK信號通路活化程度增強。9.經TREM-1激動型抗體處理的BMDMs細胞受到Poly IC刺激活化后,IFN-β、TNF-α、IL-6的分泌水平顯著上調(P0.01),IL-1β、IL-10、MCP-1的m RNA轉錄顯著增強。且RAW264.7細胞與BMDMs細胞的TREM-1受體功能存在差異。10.TREM-1受體活化的BMDMs細胞受Poly IC刺激后,MDA5、TLR3和TLR7受體表達上調;而受到短片段ds RNA刺激后表現為RIG-I表達上調。RAW264.7細胞的上述受體表達存在異常。結論:1.TREM-1受體活化選擇性促進巨噬細胞內化和細胞內殺傷大腸桿菌,從而上調促炎癥介質分泌,但并不增強細胞非特異的胞飲能力。2.敲減TREM-1表達并不能改變TLR4、MD-2等內化革蘭陰性細菌相關基因的表達。TREM-1促進巨噬細胞內化革蘭陰性細菌能力的機制可能與該受體活化能調節(jié)TLR4/MD-2受體復合體功能及細胞MAPK等信號通路活化狀態(tài)有關。3.基因組表達譜芯片及體外實驗結果證實ds RNA刺激巨噬細胞能上調TREM-1的表達,存在劑量和時間依賴性。4.TREM-1活化狀態(tài)對ds RNA誘導的抗病毒免疫反應具有重要的調節(jié)作用,參與病毒感染過程的發(fā)生、發(fā)展;而這種調節(jié)作用與其能協(xié)同增強MAPK信號通路活化及病毒相關PRR表達有關。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R392

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本文編號：1350668