本文關鍵詞：剛地弓形蟲蛋白質二硫鍵異構酶基因的克隆及原核表達

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【摘要】：目的克隆剛地弓形蟲蛋白質二硫鍵異構酶(TgPDI)基因,原核表達、純化重組TgPDI蛋白,并分析其免疫反應性。方法制備弓形蟲RH株速殖子總RNA,根據(jù)TgPDI基因全長編碼序列(登錄號為AJ306291.2)的開放閱讀框設計合成引物,并進行逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR),擴增產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后連接入pET-30a(+)載體,重組質粒pET-30a(+)-TgPDI轉化大腸埃希菌(E.coli)DH5α,陽性菌落經(jīng)PCR、雙酶切并測序鑒定。將重組質粒pET-30a(+)-TgPDI轉化至大腸埃希菌Rosetta(DE3),并加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結合考馬斯亮藍染色檢測表達產(chǎn)物;分別以抗His抗體和兔抗弓形蟲血清為一抗,蛋白質印跡(Western blotting)鑒定重組蛋白及其免疫反應性;重組蛋白His-TgPDI通過Ni2+瓊脂糖凝膠親和層析柱純化,純化蛋白經(jīng)SDSPAGE分離,考馬斯亮藍染色結合凝膠成像系統(tǒng)分析其純度。結果 RT-PCR擴增產(chǎn)物約為1 427 bp。菌落PCR、雙酶切及測序結果顯示,重組質粒pET-30a(+)-TgPDI構建成功。SDS-PAGE結果顯示,經(jīng)IPTG誘導獲得約57 kDa的可溶性重組蛋白。Western blotting結果表明,誘導表達的重組蛋白能被兔抗弓形蟲血清識別。親和純化后獲得純度大于95%的重組TgPDI蛋白質。結論克隆得到弓形蟲PDI基因,原核表達并純化出該基因編碼的蛋白,且該重組蛋白具有免疫反應性。
【作者單位】： 山西醫(yī)科大學寄生蟲學教研室;太原師范學院生物系;山西醫(yī)科大學生理學系;
【基金】：國家自然科學基金(81071374) 山西醫(yī)科大學科技創(chuàng)新基金(01201103) 山西醫(yī)科大學基礎學院331科技啟動基金(201202)
【分類號】：R382.5
【正文快照】： 剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生原蟲,可感染人類和其他溫血動物[1]。弓形蟲速殖子侵入宿主細胞后不斷分裂、增殖,繼而破壞宿主細胞,而蛋白質的正確構象對于速殖子的侵襲至關重要。弓形蟲蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)是本實驗室應用雙向電泳結合質譜技術從可溶

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1 周琳t，

本文編號：1297381