本文關鍵詞：抗TNF-α駱駝化人源sdAbs庫的構(gòu)建及篩選

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【摘要】：目的探索有效的抗體穩(wěn)定性改構(gòu)策略,篩選制備抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)穩(wěn)定、高親和力人源抗體。方法基于定點突變技術和核糖體展示技術,對人源抗體片段VH進行駱駝化穩(wěn)定性改構(gòu),構(gòu)建駱駝化人源單域抗體(single-domain antibodyies,sdAbs)庫,以TNF-α作為篩選抗原,篩選特異駱駝化人源sdAbs。結(jié)果以前期構(gòu)建的人源VH/K基因庫為模板擴增VH基因;采用定點突變方法,將VH基因FR2中的4個疏水性氨基酸突變?yōu)橛H水性氨基酸構(gòu)建人源駱駝化sdAbs基因庫;基于核糖體抗體庫技術,構(gòu)建用于核糖體展示的sdAbs基因庫;經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄翻譯后,以重組TNF-α作為篩選抗原,采用親和富集法淘選特異性抗體基因;將篩選富集mRNA的RT-PCR基因產(chǎn)物克隆,并在原核系統(tǒng)pET-22b(+)/BL21(DE3)中實現(xiàn)可溶性表達,表達產(chǎn)物經(jīng)ELISA鑒定,確認具有極高ELISA值的陽性克隆12、40,其序列分析表明是全新的抗TNF-α人源sdAbs;抗原特異性結(jié)合活性實驗顯示兩者均可以特異性識別TNF-α,而不能與狂犬病毒糖蛋白和BSA結(jié)合,表明它們是特異針對TNF-α的人源基因工程抗體,而且均有很好的抗原濃度依賴性。結(jié)論該研究將抗體穩(wěn)定性的定向改造法和進化方法相結(jié)合,篩選得到了具有較好抗原特異性和良好穩(wěn)定性的人源抗體,為穩(wěn)定性人源抗體的制備提供了理論依據(jù)及技術基礎。
【作者單位】： 天津醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程學院;軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所;解放軍254醫(yī)院;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(31070823,31270986) 天津市自然科學基金重點資助項目(11JCZDJC20800)
【分類號】：R392
【正文快照】： 腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)是具有多種生物學活性的細胞因子,對多種疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸具有重要影響�？筎NF-α抗體是治療TNF-α過量表達介導的炎癥性疾病的理想方法[1,2]。基因工程抗體由于相對分子質(zhì)量小,易于構(gòu)建和表達,是近年來抗體工程研

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本文編號：1269541