發(fā)布時間：2017-10-07 05:36

  本文關鍵詞：HuR和miR-890轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質ICAM-1、HMGB1的機制研究

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【摘要】：急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是常見臨床危重癥,治療手段缺乏。嚴重感染和創(chuàng)傷等多種誘因導致細胞間粘附分子-1(Intercellular adhesion Molecule 1, ICAM-1)、高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein 1, HMGB1)大量釋放,形成炎癥風暴,活化多種炎癥細胞,進而誘導更多炎癥因子釋放,形成失控的級聯放大式炎癥反應,最后導致大量炎癥細胞在肺部聚集和活化、血管內皮和氣道上皮屏障水腫、增厚、破壞。在發(fā)生ARDS時,內皮細胞、上皮細胞表面的ICAM-1表達增多,導致大量中性粒細胞在肺部浸潤、血管通透性增加,促進急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)展。HMGB1作為內源性信號分子,又稱為損傷相關分子模式(Danger associated molecular pattern, DAMP)是一種重要的警報素,參與細胞信號轉導,在炎癥反應中發(fā)揮促炎作用。雖然ICAM-1、HMGB1的異常表達參與急性呼吸窘迫綜合征的發(fā)生,但其調控機制仍不明確。RNA結合蛋白(RNA binding protein, RBP)和microRNA是兩種常見的轉錄后調控方式,可通過結合在mRNA的3’端非翻譯區(qū)調控基因表達。ICAM-1和HMGB1的3’端非翻譯區(qū)均存在RNA結合蛋白HuR可以作用的AU元件。此外,不同誘因導致ARDS患者外周血中microRNA譜發(fā)生顯著變化,生物信息學預測表明miR-890與HMGB1存在結合可能性。但HuR和miR-890對呼吸窘迫綜合征兩種重要的炎癥介質ICAM-1和HMGB1的轉錄后調控機制有待進一步探索。本研究探索HuR和miR-890轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質ICAM-1、HMGB1的機制,將為臨床防治多種誘因導致的ARDS提供通用治療靶點。第一部分HuR轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質ICAM-1機制研究目的：探討p38-MAPK-MK2-HuR途徑是否參與了TNF-α誘導的人肺微血管內皮細胞表達粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin及IL-8,是否進而影響中性粒細胞對血管內皮細胞的粘附。方法：收集ARDS患者外周血,檢測血清中粘附因子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表達量；體外培養(yǎng)人肺微血管內皮細胞,給予TNF-α刺激,檢測HuR蛋白和ICAM-1 mRNA結合情況：通過MK2-pcDAN3.1(+)和HuR-pcDAN3.1(+)質粒上調人肺微血管內皮細胞內MK2.HuR蛋白表達后,給予TNF-α刺激,檢測MK2、HuR、ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-8 mRNA和蛋白表達水平；觀察HuR細胞內定位情況；觀察健康人外周血分離的中性粒細胞對血管內皮細胞的粘附情況。本實驗用到的實驗方法有電泳凝膠遷移實驗、RNA結合蛋白免疫沉淀、蛋白印跡、細胞漿-胞核蛋白提取、免疫熒光、酶聯免疫吸附,實時定量PCR和放線菌素D實驗及中性粒細胞粘附實驗。結果：46例ARDS患者外周血中ICAM-1、VCAM-1、E-selectin表達增高；電泳凝膠遷移實驗、RNA結合蛋白免疫沉淀證實HuR與ICAM-1 mRAN 3'UTR區(qū)域相結合;蛋白印跡和免疫熒光結果顯示MK2促進了胞漿中HuR聚集,對胞核HuR表達無影響；HuR高表達增加了]NF-α誘導的ICAM-1和VCAM-1表達,但對E-selectin和IL-8釋放無影響：HuR提高了ICAM-1和VCAM-1 mRNA水平和穩(wěn)定性,但對E-selectin和IL-8 mRNA水平和穩(wěn)定性無影響：HuR高表達增強了中性粒細對人肺微血管內皮細胞的粘附功能。結論：ARDS患者外周血sICAM-1、sVCAM-1和E-selectin表達增高。MK2通過改變HuR亞細胞定位調控粘附因子ICAM-1、VCAM-1的表達；HuR通過與ICAM-1 mRAN 3'UTR區(qū)域相結合,增加ICAM-1 mRNA穩(wěn)定性,促進ICAM-1蛋白表達,從而增強中性粒細胞對人肺微血管內皮細胞的粘附作用；但HuR對E-selectin和IL-8釋放無影響。第二部分miR-890轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質HMGB1的機制研究目的：探究miR-890轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質HMGB1的機制。方法：收集肺部感染、腹腔感染和胰腺炎等所致ARDS患者外周血,行酶聯免疫吸附實驗檢測HMGB1水平；將3例肺部感染所致ARDS及健康對照者血清,通過Affymetrix microRNA 4.0 Array芯片檢測人源2578種microRNA表達,得到差異性變化microRNA。將上述表達存在顯著差異的microRNA分別通過Target Scan Human、miRanda和RNA22 v2 microRNA target detection 3個在線靶基因預測數據庫預測,得到其中可能與HMGB1存在潛在結合位點的microRNA。結合Target Scan及miRanda預測數據庫Context score分值排名,采用排名位于前3名的microRNA與HMGB1質粒行熒光素酶報告基因實驗,篩選出能抑制HMGB1表達的microRNA,并在46例ARDS患者血清中進一步擴大驗證其表達含量;同時,在LPS刺激的內皮細胞系(肺微血管內皮細胞、臍靜脈內皮細胞)、肺泡上皮細胞系(HBE、A549)中驗證該microRNA表達情況。在人肺微血管內皮細胞中給予microRNA模擬物,驗證是否能調控HMGB1的mRNA和蛋白表達：給予上述條件下,給予細胞LPS刺激,檢測炎癥因子、趨化因子、粘附因子及TLR2、TLR4信號通路表達情況。行電泳凝膠遷移實驗驗證HuR與HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域是否結合。結果：46例ARDS患者外周血清中HMGB1水平明顯升高；肺部感染所致ARDS患者血清microRAN芯片檢測結果示,45種microRNA在肺部感染所致ARDS患者與成年健康人血清中呈現顯著差異性表達。miR-890為下調的microRNA,下調0.48倍。LPS刺激血管內皮細胞和氣道上皮細胞后,細胞中miR-890水平降低。3種生物信息學軟件預測microRNA與HMGB1結合情況,13種microRNA有可能與HMGB1 mRNA結合。結合Target Scan、miRanda、RNA22數據庫預測情況,miR-890、miR-106a-3p和miR-140-3p.1這三種miRNA與HMGB1 mRNA3'UTR結合的可能性排名靠前。行雙熒光素酶報告基因實驗結果示3種microRNA中僅miR-890 mimics轉染293 T細胞后致使熒光素酶活性降低。對HPMEC細胞轉染miR-890mimics能抑制HMGB1蛋白及mRNA表達;給予LPS刺激后,miR-890 mimics轉染組炎癥因子IL-1β、IL-6、L-8、TNF-α,趨化因子MCP-1、RNATES,粘附因子ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達水平較對照組減少,TLR2、TLR4信號通路激活減少。HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域多處存在AU序列,電泳凝膠遷移實驗示HuR可與HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域結合。結論：ARDS患者血清中循環(huán)miR-890水平明顯降低；LPS刺激血管內皮細胞和氣道上皮細胞后,細胞中miR-890水平降低：miR-890通過與HMGB1 3'UTR區(qū)域結合,抑制HMGB1 mRNA及蛋白分子表達,在LPS刺激時削弱炎癥因子、趨化因子、粘附因子表達,TLR2、 TLR4信號通路激活減少。HuR通過與HMGB1 mRNA 3'UTR區(qū)域結合,穩(wěn)定HMGB1 mRNA3’UTR,與miR-890起到競爭作用。
【關鍵詞】：HuR ICAM-1 人肺微血管內皮細胞 中性粒細胞粘附 MK2 p38 MAPK HMGB1 miR-890 人肺微血管內皮細胞 轉錄后調控 炎癥
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R563.8
【目錄】：

• 中英文縮略詞表7-9
• 中文摘要9-12
• Abstract12-15
• 緒論15-24
• References20-24
• 第一部分 HuR轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質ICAM-1的機究研究24-72
• 引言24-32
• 一、材料與方法32-51
• 二、結果51-63
• 三、討論63-65
• 四、結論65-66
• 參考文獻66-72
• 第二部分 miR-890轉錄后調控急性呼吸窘迫綜合征炎癥介質HMGB1的機制研究72-110
• 引言72-77
• 一、材料與方法77-87
• 二、結果87-101
• 三、討論101-104
• 四、結論104-105
• 參考文獻105-110
• 全文總結110-111
• 附錄111-141
• 一、研究綜述文章111-136
• References122-136
• 二、試劑配制136-139
• 三、引物與探針序列139-140
• 四、博士期間完成文章列表140-141
• 致謝141-142

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本文編號：987243