本文關(guān)鍵詞：肺結(jié)核X染色體易感基因及全基因組關(guān)聯(lián)研究

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【摘要】：結(jié)核分支桿菌(M.tuberculosis)引起的肺結(jié)核(p TB)是世界上最致命的傳染性疾病之一。近年來,由于耐藥菌株的出現(xiàn),結(jié)核病(TB)的發(fā)病率和死亡率一直保持很高,其中死亡率高于其他任何單一傳染病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的2014年年度調(diào)查,在2012年,結(jié)核病患者總數(shù)約有860萬人,其中約66%(570萬)為新發(fā)病例,而同年死于結(jié)核病的人數(shù)約為130萬病,其中32萬人死亡時艾滋病病毒(HIV)呈陽性。中國是22個高負擔肺結(jié)核病國家之一,結(jié)核病患者數(shù)量僅次于印度,居世界第二位。雖然約1/3的世界人口感染了結(jié)核分枝桿菌,但其中只有10%發(fā)展為活動性肺結(jié)核,這說明個體對于肺結(jié)核具有不同的易感性。在這些患者中,除去有明顯危險因素(比如HIV感染、糖尿病和其他免疫缺陷狀態(tài))的患者,剩下則是由于其他因素的影響,包括遺傳因素、環(huán)境因素以及相應(yīng)的相互作用等。人類中宿主遺傳因素在導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染和引起肺結(jié)核方面起到關(guān)鍵作用已經(jīng)得到國際公認。從1983年開始,研究者為在人的基因組中篩選出肺結(jié)核病的易感基因而做出了大量的努力。眾多基于候選基因的結(jié)核病關(guān)聯(lián)研究對預(yù)測可能的功能性位點進行了檢驗,包括SLC11A1(NRAMP1)、HLA家族、Toll樣受體(TLR)家族的基因和屬于IFN-γ和IL-12信號通路的基因等。但是與其他疾病相比,結(jié)核病易感性的遺傳研究由于環(huán)境因素的復(fù)雜影響未能取得較大的成功。大多數(shù)報道出來的結(jié)核病相關(guān)位點不能在其他人群中得到驗證。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWA研究,或GWAS),也被稱為全基因組關(guān)聯(lián)研究(WGA研究,或WGAS)或共變體關(guān)聯(lián)研究(CVAS),是一種可以同時對大量個體檢測整個基因組的變異,以查看是否有變異與一個性狀相關(guān)聯(lián)。GWAS研究通常應(yīng)用在SNP位點與重大疾病之間的關(guān)聯(lián)。目前,針對非洲人群的兩個大型GWAS研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了兩個全基因組水平上的SNP位點。這個發(fā)現(xiàn)一定程度上3提供了結(jié)核病的早期干預(yù)和治療線索。中國的結(jié)核病患者在世界占第二位,然而到現(xiàn)在為止,沒有研究關(guān)注于中國漢族人群的結(jié)核病GWAS。另一方面,大量數(shù)據(jù)表明,在接觸結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展成為結(jié)核病的人群中,約70%是男性,全世界范圍內(nèi)結(jié)核病患者的男女比例高達1.9±0.6,部分國家男性患者甚至達到女性患者的三倍以上。證據(jù)還表明,相對于女性患者,男性患者的結(jié)核病更加嚴重。雖然這個現(xiàn)象可能有一定的社會經(jīng)濟和文化因素,比如在發(fā)展中國家婦女由于不受重視而被忽略了部分病情,但是這種懸殊比例的性別特異性更多被認為是由生物異質(zhì)性導(dǎo)致。這類生物因素可能包括性別偏倚、性荷爾蒙、與性別有關(guān)的遺傳因素和新陳代謝特點。因此我們可以做出一個合理的假設(shè):宿主的遺傳變異,特別是在X染色體上免疫相關(guān)基因的某些變異可能有助于解釋結(jié)核病發(fā)病率的性別特異性。第一部分肺結(jié)核全基因組關(guān)聯(lián)研究目的:人類中宿主遺傳因素在導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌感染和引起肺結(jié)核方面起到關(guān)鍵作用已經(jīng)得到國際公認。目前為止,基于病例對照的肺結(jié)核GWAS研究已經(jīng)在2個非洲人群(加納和岡比亞)發(fā)現(xiàn)了全基因組水平上的關(guān)聯(lián)SNP位點,并且在另一個人群中得到了一定程度的驗證。本課題的目標是在中國漢族人群中用GWAS研究來全面評估遺傳位點和肺結(jié)核的關(guān)聯(lián)性。對象和方法:為了在中國漢族人群中鑒定遺傳標記,我們對500例肺結(jié)核病例和600例健康對照進行全基因組基因分型。經(jīng)過了對每個樣本和位點的嚴格的質(zhì)量控制后,共有483例肺結(jié)核病例和587例健康對照的650,939個SNP保留并進行下一步的統(tǒng)計分析。我們應(yīng)用多維尺度模型(MDS)校正人群分層,并且使用前3個MDS向量作為協(xié)變量用于之后的logistic回歸分析。接下來,我們使用千人基因組計劃(1000 Genomes Project)的數(shù)據(jù)對我們的分型結(jié)果實施基因填補,經(jīng)過標準的質(zhì)量控制后,共獲得了5,692,315個填補的SNP位點。為驗證是否存在中國漢族人群和非洲人群的共同肺結(jié)核病易感位點,我們對本研究的中國漢族數(shù)據(jù)集與已經(jīng)發(fā)表的加納肺結(jié)核GWAS數(shù)據(jù)集(1359例病例,1952對照;793,694個分型的SNP位點;5,426,380填補的SNP位點)實施了meta分析�？傆嫻灿�1537個SNP位點進行驗證階段的基因分型,驗證階段的受試對象包括中國漢族1272例病例和1733例對照以及蒙古族121例病例和231例對照。結(jié)果和結(jié)論:合并分析中國漢族人群的GWAS第一階段結(jié)果和兩個驗證人群的結(jié)果后,SNP位點rs932347達到了全基因組水平的關(guān)聯(lián)(Padditive=1.45 10~(-9);OR=0.69;95%CI=0.61-0.78)。由于SNP位點rs932347在中國漢族人群的次等位基因頻率為17%,而在加納人群中僅有1.5%,屬于罕見變異位點,因此未發(fā)現(xiàn)其在加納人群中表現(xiàn)出與肺結(jié)核病的關(guān)聯(lián)性。然而,由于部分加納人群的肺結(jié)核病例是由一種只發(fā)生在非洲的結(jié)核分枝桿菌(M.africanum)所感染,當我們?nèi)コ@一部分病例后,發(fā)現(xiàn)在SNP位點rs932347對于加納人群的同樣起到保護效果,OR值為0.84,這與在中國漢族人群和蒙古人群觀察到的結(jié)果方向一致。rs4331426和rs2057178這兩個在加納人群中被確認的肺結(jié)核易感性位點未在中國漢族人群中表現(xiàn)出任何關(guān)聯(lián)。同樣,我們認為這個結(jié)果可部分歸結(jié)為不同人群中等位基因頻率的差別。rs4331426G和rs2057178A的等位基因頻率在中國漢族人群中僅為4%和5%,而在加納人群中分別為45%和32%�？傊�,我們通過一個三階段的全基因組關(guān)聯(lián)研究在中國漢族人群中發(fā)現(xiàn)了一個對肺結(jié)核病起保護作用的新的SNP位點。第二部分肺結(jié)核X染色體易感基因病例對照研究目的:在接觸結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展成為結(jié)核病的人群中,約70%是男性,因此,宿主的遺傳變異,特別是X染色體上的免疫相關(guān)基因可能與結(jié)核病性別特異性相關(guān)聯(lián)。為了鑒定這個假設(shè),我們選取X染色體的三個SNP位點(TLR8基因的rs3764880、CD40LG基因的rs3092923和IRAK1基因的rs3027898),應(yīng)用病例對照研究設(shè)計,以確定在中國漢族人群中上述位點多態(tài)性與肺結(jié)核病發(fā)病間的聯(lián)系。對象和方法:我們共納入符合納入標準的1011例肺結(jié)核病例和1105例正常對照,其中923例病例和1033例對照的樣本最終通過了測序平臺的樣本質(zhì)量檢測。肺結(jié)核病住院病例于2007年3月至2009年8月從河北省胸科醫(yī)院和石家莊市第五醫(yī)院收集。健康對照是從北京電力醫(yī)院進行年度體檢的人群中選取。本研究方案已經(jīng)經(jīng)過河北省胸科醫(yī)院、石家莊市第五醫(yī)院和北京電力醫(yī)院倫理委員會的審核。在獲得所有病例組和對照組受試者的書面知情同意后,我們才進行5ml全靜脈EDTA抗凝血液樣本的收集工作。應(yīng)用三種多重logistic回歸分析(男性和女性的合并分析、男性單獨分析和女性單獨分析)分別對三個SNP位點的兩種遺傳模型(共顯性和隱性模型)進行建模,并對年齡,性別,吸煙狀況和接種卡介苗等因素進行校正。除此之外,應(yīng)用隱性遺傳模型的多重logistic回歸分析對男性和女性的合并數(shù)據(jù)進行性別和SNP位點的交互作用分析。結(jié)果和結(jié)論:在對三個位點分別進行的含有位點與性別交互作用項隱性遺傳模型的多重Logistic回歸分析結(jié)果中,只有CD40LG rs3092923的交互作用項(CT+CC或C/(-)與性別)有統(tǒng)計學(xué)意義,多重檢驗校正后P_(corr)=0.0213,OR_(男性)[95%CI_(男性)]=0.47[0.32-0.70]。由于該交互作用經(jīng)過了年齡、吸煙和卡介苗接種狀況因素的校正,消弱了這些非試驗因素的影響,說明CD40LG rs3092923可能對肺結(jié)核病的性別特異性產(chǎn)生作用。而對于TLR8 rs3764880和IRAK1 rs3027898位點與性別的交互作用項無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.5008和0.9213)。CD40LG rs3092923以及它與另外兩個位點的聯(lián)合作用均只在男性中表現(xiàn),在男性中,當以野生型T/(-)作為參考時,C/(-)基因型對肺結(jié)核病表現(xiàn)出較強的保護作用(OR=0.52,95%CI=0.35-0.78,Pcorr.=0.0045)。若以沒有風險等位基因的作為參照,隨著三個SNP位點推定的風險等位基因累計數(shù)的增加,受試者中患肺結(jié)核病的風險越來越大,呈逐級遞增的趨勢。其效果從有一個累計風險等位基因時的OR=2.58,到有兩個累計風險等位基因時的OR=2.83,再到有三個累計風險等位基因時的OR=2.96。對剩余的兩個SNP位點,僅在女性單獨分析和聯(lián)合分析模型的IRAK1rs3027898AA基因型上發(fā)現(xiàn)較弱的差異。我們的研究結(jié)果表明男性中,CD40LG基因的變異以及它和另外兩個基因的聯(lián)合作用與肺結(jié)核易感性相關(guān)聯(lián)。
【關(guān)鍵詞】：肺結(jié)核病 全基因組關(guān)聯(lián)研究 單核苷酸多態(tài)性 X染色體 病例對照研究
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R521
【目錄】：

• 縮略語6-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-16
• 前言16-20
• 一、研究背景16-18
• 二、本課題研究計劃18-20
• 第一部分 肺結(jié)核的全基因組關(guān)聯(lián)研究20-49
• 概述20-22
• 材料22
• 方法22-31
• 一、研究方案22-25
• 二、研究人群25-27
• 三、DNA提取27-28
• 四、基因分型、基因填補和樣本與位點的質(zhì)量控制28-30
• 五、統(tǒng)計學(xué)分析30-31
• 結(jié)果31-47
• 一、研究人群的人口統(tǒng)計學(xué)信息31-32
• 二、GWAS第一階段質(zhì)量控制結(jié)果32-38
• 三、基因分型數(shù)據(jù)分析結(jié)果38-47
• 討論47-49
• 第二部分 肺結(jié)核X染色體易感基因病例對照研究49-69
• 概述49-51
• 材料與方法51-54
• 一、受試者和樣本收集51-52
• 二、DNA提取和多態(tài)性位點測序52
• 三、統(tǒng)計分析52-54
• 結(jié)果54-63
• 一、研究人群和人口統(tǒng)計學(xué)信息54-55
• 二、三個X染色體基因SNP位點在病例與對照中的單獨作用55-60
• 三、三個X染色體基因SNP位點在病例與對照中的聯(lián)合作用60-63
• 討論63-69
• 結(jié)論69-71
• 參考文獻71-75
• 附錄1 肺結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查表75-77
• 附錄2 1537 個選入驗證階段的SNP列表77-102
• 綜述102-114
• 參考文獻109-114
• 博士期間發(fā)表論文114-116
• 第一作者論文114
• 其他作者論文114-116
• 附件116-121
• 個人簡歷121-122
• 致謝12

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本文編號：982648