本文關(guān)鍵詞：酪氨酸激酶受體DDR2信號在小鼠肺纖維化模型中的作用及干預(yù)研究

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【摘要】：肺纖維化是一種高度異質(zhì)且致命的肺部疾病。病毒感染、放射治療,接觸化療藥物及霧化的環(huán)境毒素等因素可引起肺纖維化的發(fā)生。肺纖維化的發(fā)生大致經(jīng)歷以下幾個過程:瘢痕的形成引起肺結(jié)構(gòu)不可逆的破壞,進(jìn)而導(dǎo)致器官功能故障,氣體交換受到干擾,導(dǎo)致呼吸衰竭死亡,最終嚴(yán)重威脅人們的身體健康。DDRs是進(jìn)化上高度保守的受體酪氨酸激酶家族之一,包含DDR1和DDR2兩個成員,主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的信號傳遞。正常生理條件下,DDRs可結(jié)合多種不同類型的膠原蛋白,在胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要作用。當(dāng)DDRs信號發(fā)生紊亂,則會導(dǎo)致諸如關(guān)節(jié)炎、癌癥、成骨發(fā)育不全等疾病的發(fā)生。與此同時,DDRs還廣泛參與細(xì)胞命運的決定,包括細(xì)胞遷移,細(xì)胞存活,增殖和分化,以及細(xì)胞外基質(zhì)重塑等。前期研究表明DDR1基因敲除小鼠能有效的避免博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)生;與此同時,DDR2高表達(dá)于小鼠肺組織中。因此我們推測DDR2信號通路可能在肺纖維化的發(fā)生發(fā)展中扮演重要作用。我們主要從如下幾個方面進(jìn)行了研究:1.肺組織局部過表達(dá)或下調(diào)DDR2的表達(dá),觀察干預(yù)對肺纖維化病理進(jìn)程的影響。2.免疫組織化學(xué)、免疫熒光等實驗明確DDR2在人肺組織中的組織細(xì)胞定位,并在小鼠原代細(xì)胞中觀察DDR2對細(xì)胞功能的調(diào)控機制研究。3.免疫熒光和Realtime-PCR等實驗分析DDR2對肺纖維化誘導(dǎo)血管新生的影響。4.DDR2參與肺纖維化晚期組織修復(fù)的研究初探。5.小分子抑制劑D856、Dasatinib的抗肺纖維化研究。6.TSGA13基因功能初探。結(jié)論:膠原受體DDR2促進(jìn)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化進(jìn)程
【關(guān)鍵詞】：DDR2 肺纖維化 肌成纖維細(xì)胞 血管新生 小分子抑制劑
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R563;R-332
【目錄】：

• 縮略語表7-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-40
• 第一部分 肺纖維化14-24
• （一）IPF發(fā)病機制14-16
• 階段一：損傷15
• 階段二：炎癥15-16
• 階段三：纖維化16
• （二）肌成纖維細(xì)胞myo Fbs與肺纖維化16-19
• myo Fbs的來源16-17
• myo Fbs的活化17-18
• myo Fbs的特點及功能18
• myo Fbs的失活18-19
• （三）TGF信號通路與肺纖維化19-20
• （四）血管新生與肺纖維化20-21
• （五）肺纖維化模型21-22
• （六）肺纖維化治療靶點22-24
• 第二部分 DDRS信號通路24-40
• （一）DDRs概述24-36
• DDRs基因24-26
• DDRs蛋白26-29
• 膠原誘導(dǎo)DDRs活化29-36
• （二）DDRs生物學(xué)功能36-40
• DDRs與發(fā)育36-37
• DDRs與疾病37-40
• 第一部分 DDR2 信號對肺纖維化病理進(jìn)程的影響40-62
• 1 實驗材料40-44
• 1.1 實驗動物40
• 1.2 主要試劑40-41
• 1.3 常用緩沖液41-44
• 1.4 主要儀器44
• 2 實驗方法44-54
• 2.1 鼠尾基因組的提取44-45
• 2.2 小鼠基因型的鑒定45-46
• 2.3 博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型的建立46
• 2.4 新鮮肺組織的獲取及固定包埋46-47
• 2.5 肺組織切片染色47-50
• 2.6 免疫印跡（Western Blot）50-52
• 2.7 羥脯氨酸含量測定（HYP）52
• 2.8 小鼠siRNA的肺部給藥52-53
• 2.9 小鼠腺病毒的肺部給藥53
• 2.10 電鏡觀察53-54
• 3 實驗結(jié)果54-60
• 3.1 DDR2 促進(jìn)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化的發(fā)生54-60
• 4 討論60-62
• 第二部分 DDR2 調(diào)控肌成纖維細(xì)胞的活化62-80
• 1 實驗材料62-64
• 1.1 人體標(biāo)本62-63
• 1.2 實驗動物63
• 1.3 主要試劑和試劑盒63
• 1.4 抗體63
• 1.5 緩沖液和培養(yǎng)基63-64
• 1.6 主要設(shè)備64
• 2 實驗方法64-68
• 2.1 免疫組化64
• 2.2 原代細(xì)胞培養(yǎng)64-65
• 2.3 免疫熒光65
• 2.4 Realtime PCR65-67
• 2.5 WesternBloting67-68
• 3 實驗結(jié)果68-78
• 3.1 DDR2 高表達(dá)于IPF肺組織并與α-SMA共定位68-69
• 3.2 DDR2 參與TGF-β1 誘導(dǎo)的myo Fbs的活化69-71
• 3.3 DDR2 誘導(dǎo)myoFbs形成的分子機制71-78
• 4 討論78-80
• 第三部分 DDR2 調(diào)控肺纖維化過程中的血管新生80-87
• 1 實驗材料80-81
• 1.1 實驗動物80-81
• 1.2 主要試劑和試劑盒81
• 1.3 抗體81
• 1.4 主要設(shè)備81
• 2 實驗方法81-82
• 2.1 組織免疫熒光81
• 2.2 Realtime PCR81-82
• 2.3 Western Bloting82
• 3 實驗結(jié)果82-86
• 3.1 博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化后肺組織的微血管密度增加82-86
• 4 討論86-87
• 第四部分 DDR2 小分子抑制劑D856 的抗纖維化研究87-99
• 1 實驗材料87-88
• 1.1 實驗動物87-88
• 1.2 主要試劑88
• 1.3 抗體88
• 1.4 主要設(shè)備88
• 2 實驗方法88-89
• 2.1 Western Bloting88
• 2.2 Realtime PCR88-89
• 2.3 免疫組化89
• 2.4 HE染色和Masson染色89
• 2.5 羥脯氨酸HYP含量測定89
• 2.6 免疫熒光染色89
• 3 實驗結(jié)果89-97
• 3.1 D856 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式89
• 3.2 D856 的半數(shù)抑制濃度的測定89-90
• 3.3 D856 抑制膠原誘導(dǎo)myoFbs活化（體外實驗）90-91
• 3.4 D856 抑制肺纖維化的進(jìn)程（體內(nèi)實驗）91-95
• 3.5 Dasatinib抑制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化過程95-97
• 4 討論97-99
• 第五部分 DDR2 調(diào)控肺纖維化的組織修復(fù)過程99-107
• 1 實驗材料99-100
• 1.1 實驗動物99
• 1.2 主要試劑99
• 1.3 抗體99
• 1.4 主要設(shè)備99-100
• 2 實驗方法100
• 2.1 Western Bloting100
• 2.2 Realtime PCR100
• 2.3 免疫組化100
• 2.4 HE染色和Masson染色100
• 2.5 羥脯氨酸HYP含量測定100
• 3 實驗結(jié)果100-106
• 3.1 博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化不同時間點DDR2 及其磷酸化的表達(dá)變化100-101
• 3.2 早期干預(yù)DDR2 的表達(dá)及其磷酸化抑制肺纖維化的發(fā)生101-104
• 3.3 晚期干預(yù)DDR2 的表達(dá)及其磷酸化延緩肺纖維化的進(jìn)程104-106
• 4 討論106-107
• 第六部分 肺纖維化相關(guān)基因TSGA13 的功能研究107-117
• 1 實驗材料107-108
• 1.1 實驗動物107
• 1.2 組織芯片和人結(jié)腸癌和鄰近正常組織標(biāo)本107
• 1.3 主要試劑107-108
• 1.4 主要設(shè)備108
• 2 實驗方法108-109
• 2.1 基因樹的構(gòu)建108
• 2.2 蛋白同源比對108
• 2.3 TSGA13 siRNA的合成、溶解及滴鼻入肺108
• 2.4 Western Bloting108
• 2.5 免疫組化108-109
• 2.6 Masson染色109
• 3 實驗結(jié)果109-116
• 3.1 下調(diào)TSGA13 表達(dá)肺纖維化狀況減輕109
• 3.2 TSGA13 基因樹109-111
• 3.3 TSGA13 蛋白質(zhì)同源性分析111-112
• 3.4 TSGA13 抗體特異性的鑒定112
• 3.5 正常組織中TSGA13 的表達(dá)112-114
• 3.6 腫瘤組織中TSGA13 的表達(dá)114-116
• 4 討論116-117
• 小結(jié)117-119
• 參考文獻(xiàn)119-132
• 個人簡歷和研究成果132-134
• 個人情況132
• 學(xué)習(xí)與工作經(jīng)歷132
• 研究發(fā)表論文132-134
• 致謝134

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本文編號：968636