本文關鍵詞：IL31與特發(fā)性肺纖維化信號轉導機制研究

  更多相關文章： 特發(fā)性肺纖維化 地塞米松 博來霉素 羥基脯氨酸 TGF-β1 IL-31 Smad3 JAKs/STATs

【摘要】：目的：在特發(fā)性肺纖維化(IPF)過程中,起主要作用的TGF-β在炎癥部位活性增強,使成纖維細胞大量增殖,導致嚴重肺纖維化,TGF-β通過Smads蛋白的信號轉導及調控發(fā)揮作用。而Smad-3是介導TGF-β誘導肺纖維化的關鍵分子,其通過調節(jié)靶基因而影響IL-6家族特別是IL-31的表達,進一步影響JAKs/STATs通路,從而引起肺纖維化。這是肺纖維化可能的機制。因此,本項目旨在利用體外培養(yǎng)細胞及BLM誘導小鼠肺纖維化模型,得到TGF-β1-Smad-3-IL-31-JAKs/STATs這條通路,研究這條通路是肺纖維化的可能作用機制,以對肺纖維化的靶向治療提供一定的線索。 方法：將75只小鼠按隨機數(shù)字表法分為3組。其中二組為博來霉素誘導肺纖維化模型組(氣管內注射BLM5mg/kg0.1mL),分別為單純造模組(BLM組,25只)、地塞米松治療組(DXM組,25只)、每組25只；造模后1天,地塞米松組小鼠腹腔注射DXM5mg/kg1(0.1mL),每天1次,連續(xù)28天。另1組為正常對照組(NC組,25只)。給藥第3、7、14、21、28天每組分別各處死5只小鼠。取肺組織行常規(guī)組織病理學觀察；免疫組化檢測肺組織中TGF-β1、Smad-3含量;RT-PCR法檢測IL-31、STAT-1mRNA的表達量；Western blot測STAT-1蛋白含量；染色質免疫共沉淀(CHIP)實驗檢測Smad-2/3與IL-31啟動子之間的結合聯(lián)系。同時制得原代肺成纖維細胞,待培養(yǎng)3代后,抑制TGF-β表達,而對TGF-β表達的抑制,會下調Smad-3、IL-31的表達水平。對IL-31表達的降低,則會下調STAT-1的表達水平。同時查看肺成纖維細胞的形態(tài),肺成纖維細胞的增殖特征,肺成纖維細胞的膠原合成；檢測肺組織中羥基脯氨酸(HYP)含量。 結果： (1)對小鼠肺初步肉眼觀察和對肺組織病理學的觀察,可發(fā)現(xiàn)由于BLM的誘導作用,BLM組小鼠的肺組織根據(jù)時間先后順序出現(xiàn)由3天時的輕度肺泡炎到14天時纖維化的動態(tài)改變。DXM組也呈現(xiàn)類似的病理改變過程,但其程度較BLM組輕,但是,對比NC組,其程度卻明顯加重。NC組病理變化基本未見,沒有明顯的肺泡炎和纖維化改變。 (2) TGF-β1在NC組肺組織有弱表達,在BLM組7天-14天表達達高峰,有統(tǒng)計學意義(p0.01)。28天TGF-β1表達明顯降低。DXM組7天-14天后的TGF-β1明顯低于BLM組,地塞米松能夠明顯降低TGF-β1的表達。 BLM組肺組織Smad3表達增強,第7天時明顯高于NC組,隨后下降,但直至第28天時BLM組中Smad3的表達仍明顯高于NC組。DXM組小鼠各時間點肺組織Smad3表達水平均明顯低于BLM組。 (3)跟NC組相比,BLM組的IL-31及STAT-1mRNA從第7天開始升高,第14天達到高峰,后逐漸下降,但到28天仍高于NC組。有明顯的統(tǒng)計學意義(p0.05)。 DXM組小鼠各時間點肺組織IL-31及STAT-1mRNA表達水平明顯低于實驗組。 經Western blot法檢測STAT-1蛋白發(fā)現(xiàn)NC組小鼠肺內僅有少量STAT-1蛋白表達。BLM組小鼠的病變早期(第7天),肺組織中的STAT-1蛋白表達水平即增高,且隨時間延長呈增高趨勢,到第14天時達到高峰,第28天下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。DXM組也呈現(xiàn)類似的趨勢,但比BLM組的表達明顯減輕,有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.05)。 (4)用抗Smad-3抗體進行免疫沉淀蛋白質DNA交聯(lián)復合物,用RT-PCR檢測IL-31啟動子,發(fā)現(xiàn)與NC組相比,BLM組的IL-31啟動子明顯增高。第21天達到高峰,到28天仍明顯增高,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 (5)對TGF-β表達的抑制,則會下調Smad-3、IL-31的表達水平。 (6)而對IL-31表達的降低,則會下調STAT-1的表達水平。 (7)BLM組與NC對照組相比,肺組織中羥基脯氨酸含量第14天開始上升,第28天達到峰值(p0.01)；DXM治療組HYP含量于14-28天有明顯下降(p0.05)。 結論： 我們利用免疫組織化學、Western blot. RT-PCR及CHIP等方法對博來霉素誘導的肺纖維化模型中TGF-β1、Smad-3、IL-31、STAT-1的表達水平進行了檢測,發(fā)現(xiàn)這四者在一定程度上,具有表達水平共同升高或者降低的趨勢,而CHIP的使用,則進一步證明了前人并沒有證明的Smad-3通過與Il-31的結合而誘發(fā)下游JAK/STAT通路激活的作用。
【關鍵詞】：特發(fā)性肺纖維化 地塞米松 博來霉素 羥基脯氨酸 TGF-β1 IL-31 Smad3 JAKs/STATs
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要7-10
• ABSTRACT10-18
• 注釋表18-20
• 第一章 緒論20-36
• 1.1 特發(fā)性肺纖維化概述20-21
• 1.2 特發(fā)性肺纖維化發(fā)病機制研究進展21-26
• 1.2.1 肺泡上皮細胞受損21-22
• 1.2.2 成纖維細胞增殖和膠原產生細胞的聚集22
• 1.2.3 上皮-間質轉化22-23
• 1.2.4 細胞調亡23
• 1.2.5 細胞因子的作用23-25
• 1.2.6 凝血—纖溶系統(tǒng)25
• 1.2.7 Wnt信號途徑25-26
• 1.2.8 Rho/Rho激酶信號通路26
• 1.3 特發(fā)性肺纖維化臨床治療進展26-29
• 1.3.1 糖皮質激素治療26-27
• 1.3.2 細胞毒性藥物27
• 1.3.3 針對細胞氧化/抗氧化失衡的抗氧化和自由基治療27-28
• 1.3.4 IPF的抗凝治療28
• 1.3.5 抗纖維化28
• 1.3.6 肺移植28-29
• 1.3.7 其它29
• 1.4 特發(fā)性肺纖維化與TGF-β信號通路的關系29-33
• 1.5 IPF動物模型33-34
• 1.6 本課題研究的目的及意義34-35
• 1.7 技術路線35-36
• 第二章 博來霉素誘導肺纖維化模型制備及組織形態(tài)學觀察36-47
• 2.1 材料與方法36-42
• 2.1.1 材料36-38
• 2.1.2 方法38-41
• 2.1.3 統(tǒng)計學方法41-42
• 2.2 結果42-45
• 2.2.1 肉眼初步對組織進行觀察42-44
• 2.2.2 肺泡炎及肺纖維化評分結果44-45
• 2.3 討論45-47
• 第三章 免疫組化檢測TGF-β1與Smad3的表達水平47-57
• 3.1 材料與方法47-52
• 3.1.1 材料47-49
• 3.1.2 方法49-51
• 3.1.3 統(tǒng)計學方法51-52
• 3.2 結果52-54
• 3.2.1 免疫組織化學技術檢測肺組織中TGF-β1表達52-53
• 3.2.2 免疫組織化學方法檢測肺組織中Smad3蛋白的表達水平53-54
• 3.3 討論54-57
• 第四章 IL-31、STAT-1的表達水平檢測57-72
• 4.1 材料與方法57-67
• 4.1.1 材料57-59
• 4.1.2 方法59-66
• 4.1.3 統(tǒng)計學方法66-67
• 4.2 結果67-69
• 4.2.1 IL-31的表達水平67-68
• 4.2.2 小鼠肺組織STAT-1蛋白表達水平68-69
• 4.3 討論69-72
• 第五章 染色質共沉淀法檢測Smad-3與IL-31啟動子的結合72-78
• 5.1 材料與方法72-75
• 5.1.1 材料72-74
• 5.1.2 方法74-75
• 5.1.3 統(tǒng)計學方法75
• 5.2 結果75-76
• 5.3 討論76-78
• 第六章 TGF-β通路抑制劑SB431542處理細胞影響Smad-3的表達78-83
• 6.1 材料與方法78-81
• 6.1.1 材料78-80
• 6.1.2 方法80-81
• 6.2 結果81-82
• 6.3 討論82-83
• 第七章 敲減IL-31對STAT-1的表達影響83-87
• 7.1 材料與方法83-85
• 7.1.1 材料83-85
• 7.1.2 方法85
• 7.2 結果85-86
• 7.3 討論86-87
• 第八章 地塞米松對細胞因子及羥脯氨酸的影響87-92
• 8.1 材料與方法87-89
• 8.1.1 材料87-88
• 8.1.2 方法88-89
• 8.1.3 統(tǒng)計學方法89
• 8.2 結果89-90
• 8.3 討論90-92
• 第九章 主要結論與展望92-94
• 9.1 結論92
• 9.2 創(chuàng)新點92-93
• 9.3 展望93-94
• 參考文獻94-113
• 綜述113-118
• 參考文獻116-118
• 攻讀博士學位期間發(fā)表論文118-119
• 致謝119

【共引文獻】

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本文編號：890133