本文關(guān)鍵詞：塵螨疫苗治療對呼吸道天然免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究

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【摘要】：目的:研究表明支氣管哮喘削弱肺部天然免疫,增加感染和定植風(fēng)險,塵螨疫苗特異性免疫治療對哮喘有較好的療效,而塵螨疫苗對肺部天然免疫的影響目前未見報道,因此本實驗研究塵螨疫苗對哮喘宿主抗感染能力的影響,并探討其可能的起效機(jī)制。方法:1.動物實驗:①4-6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為PBS對照組、哮喘組和塵螨疫苗治療組。哮喘組和治療組通過3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型,治療組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù),對照組全程同步作PBS對照處理。末次激發(fā)24h后,測定小鼠氣道反應(yīng)性,肺泡灌洗液細(xì)胞分類計數(shù),肺組織病理學(xué)檢查,ELISA法測血清中抗原特異性Ig E、IgG1和IgG2a水平。②4-6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為PBS對照組、感染組、哮喘感染組和塵螨疫苗感染組。哮喘感染組和塵螨疫苗感染組通過3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型,塵螨疫苗感染組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù),感染組用PBS代替致敏、治療和激發(fā),感染組、哮喘感染組和塵螨疫苗感染組在末次激發(fā)后24h滴鼻感染綠膿桿菌,對照組全程同步作PBS對照處理。感染24h后測定小鼠肛溫,肺泡灌洗液中細(xì)胞分類計數(shù)和細(xì)菌含量觀察,肺組織病理學(xué)檢查,肺勻漿涂板測定細(xì)菌負(fù)荷量。③4-6周齡SPF級雌性Balb/c小鼠隨機(jī)分為PBS對照組、哮喘組和塵螨疫苗治療組。哮喘組和治療組通過3次腹腔注射致敏和7次滴鼻激發(fā)建立哮喘模型,治療組激發(fā)前進(jìn)行皮下免疫治療8次干預(yù),對照組全程同步作pbs對照處理。末次激發(fā)24h后elisa法測定小鼠肺泡灌洗液中抗菌肽cramp(cathelicidinrelatedantimicrobialpeptide)水平,免疫熒光法和實時熒光定量pcr法檢測肺組織中cramp蛋白和基因表達(dá),elisa法檢測肺泡灌洗液中il-4、ifn-γ、il-10和tgf-β1濃度,免疫組織化學(xué)法檢測cyp27b1表達(dá)。2.細(xì)胞實驗:①空白培養(yǎng)基、25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3、ifn-γ+25(oh)2vd3、il-10+25(oh)2vd3、tgf-β1、ifn-γ、il-10和1,25(oh)2vd3刺激人支氣管上皮細(xì)胞后,實時熒光定量pcr法測人抗菌肽camp(cathelicidinantimicrobialpeptide)表達(dá)。②不同濃度tgf-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞后,實時熒光定量pcr和免疫印跡法檢測cyp27b1蛋白和基因表達(dá)。③itra預(yù)處理后,經(jīng)25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3和tgf-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞,免疫印跡法和實時熒光定量pcr檢測人抗菌肽camp蛋白和基因表達(dá)。④itra預(yù)處理后,經(jīng)25(oh)2vd3、tgf-β1+25(oh)2vd3和tgf-β1刺激人支氣管上皮細(xì)胞,再綠膿桿菌感染細(xì)胞,細(xì)胞勻漿涂板測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌含量。結(jié)果:1.動物實驗:①塵螨疫苗治療后小鼠penh值明顯低于哮喘組(p0.01),肺泡灌洗液中各炎性細(xì)胞均減少(均p0.01),血清中特異性ige和igg1比哮喘組降低(均p0.01),igg2a高于哮喘組(p0.01),肺組織氣道炎癥減輕。②經(jīng)塵螨疫苗治療的小鼠肛溫低于哮喘感染組(p0.01),肺泡灌洗液中各炎性細(xì)胞均減少(均p0.01),肺組織中和肺泡灌洗液中的細(xì)菌負(fù)荷均減少(均p0.01),肺組織感染病變減輕。③塵螨疫苗治療后小鼠肺泡灌洗液中cramp含量增加(p0.01),肺組織中cramp的mrna(p0.01)和蛋白(p0.01)表達(dá)均升高,肺泡灌洗液中IFN-γ、TGF-β1和IL-10表達(dá)增高(均P0.01),IL-4表達(dá)降低(P0.01),肺組織中CYP27b1表達(dá)增加。2.細(xì)胞實驗:①TGF-β1+25(OH)2 VD3組、25(OH)2 VD3組和1,25(OH)2 VD3組細(xì)胞CAMP mRNA表達(dá)上調(diào)(均P0.01),且TGF-β1+25(OH)2 VD3組比25(OH)2 VD3組更高(P0.05)。②濃度為0.1ng/ml、1ng/ml和10ng/ml的TGF-β1增加人支氣管上皮細(xì)胞CYP27b1蛋白和mRNA的表達(dá)(均P0.01)。③ITRA降低TGF-β1+25(OH)2 VD3對CAMP蛋白和mRNA的上調(diào)作用(均P0.01)。④TGF-β1+25(OH)2 VD3(P0.01)和25(OH)2 VD3(P0.05)減少細(xì)胞內(nèi)入侵的細(xì)菌數(shù),并且TGF-β1+25(OH)2 VD3組比25(OH)2 VD3組(P0.05)菌落數(shù)更少,而ITRA抑制了TGF-β1+25(OH)2 VD3的作用(P0.01)。結(jié)論:塵螨疫苗能有效減輕塵螨誘導(dǎo)的過敏性哮喘,并同時能通過上調(diào)抗菌肽Cathelicidin表達(dá)增強(qiáng)哮喘小鼠肺部抗菌能力,這可能是通過上調(diào)TGF-β1而增加CYP27b1的表達(dá)間接升高Cathelicidin在呼吸道的表達(dá),從而增強(qiáng)肺部抵抗微生物的天然免疫應(yīng)答。
【關(guān)鍵詞】：哮喘 塵螨疫苗特異性免疫治療 天然免疫 Cathelicidin TGF-β1
【學(xué)位授予單位】：四川醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R562.25
【目錄】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-34
• 1 實驗器材與儀器15
• 2 主要實驗試劑15-18
• 3 主要溶液配制18
• 4 主要實驗儀器18-19
• 5 試驗方法19-33
• 6 統(tǒng)計學(xué)處理33-34
• 結(jié)果34-41
• (1)塵螨疫苗減輕塵螨誘導(dǎo)的小鼠哮喘34-35
• (2)塵螨疫苗減輕哮喘小鼠肺部綠膿桿菌感染35-37
• (3)塵螨疫苗上調(diào)哮喘小鼠呼吸道CRAMP表達(dá)37-38
• (4) TGF-β1增加CYP27b1表達(dá)而增高HBE細(xì)胞表達(dá)CAMP38-40
• (5)塵螨疫苗上調(diào)哮喘小鼠肺部CYP27b1蛋白表達(dá)40-41
• 附：圖表41-55
• 討論55-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 英漢縮略詞對照表66-68
• 致謝68-69
• 綜述69-79
• 參考文獻(xiàn)75-79

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：847693