本文關(guān)鍵詞：表達(dá)Ag85A-IL-17A重組恥垢分枝桿菌構(gòu)建及抗氣道炎癥反應(yīng)機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 重組恥垢分枝桿菌 白介素-17A 自身抗體 氣道炎癥反應(yīng)

【摘要】：氣道炎癥反應(yīng)是多種呼吸系統(tǒng)疾病的共同病理特征,主要包括感染性氣道炎癥反應(yīng)和過(guò)敏性氣道炎癥反應(yīng)。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是呼吸系統(tǒng)最常見(jiàn)的感染病原體,其感染后氣道炎癥反應(yīng)以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主。哮喘則是以氣道炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性和氣道黏液分泌增加等為特征的過(guò)敏性疾病,中性粒細(xì)胞在其病理過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。目前研究發(fā)現(xiàn),Th17細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子IL-17A、IL-17F等在以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此,拮抗IL-17A和IL-17F的功能成為抑制氣道炎癥反應(yīng)的重要途徑。我們對(duì)IL-17A和IL-17F與肺炎鏈球菌感染所致氣道炎癥反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究IL-17A和IL-17F與過(guò)敏性氣道炎癥反應(yīng)的相互關(guān)系。根據(jù)Lanre Delavallée的理論,當(dāng)自身蛋白與外源性蛋白結(jié)合,通過(guò)外源性蛋白提供Th細(xì)胞抗原表位,可激活T-B細(xì)胞反應(yīng),活化B細(xì)胞,產(chǎn)生抗自身蛋白的抗體。因此,我們?cè)O(shè)想若在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A和IL-17F的自身抗體,抑制IL-17A和IL-17F的功能,可望有效減輕氣道炎癥反應(yīng)。恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)無(wú)致病性,且具有免疫調(diào)節(jié)功能,是基因工程疫苗的常用載體。Ag85A是卡介苗(BCG)免疫原性較強(qiáng)的分泌蛋白復(fù)合體Ag85的組分之一,能夠促進(jìn)Th1型免疫反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌疫苗,以Ag85A為外源性蛋白提供Th細(xì)胞抗原表位,在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A和IL-17F自身抗體,研究其抗氣道炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制。目的:構(gòu)建表達(dá)Ag85A-IL-17A/F重組恥垢分枝桿菌r MS-Ag85a-IL-17a/f,體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A和IL-17F自身抗體,并探討其抗氣道炎癥反應(yīng)相關(guān)機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)擬分三步進(jìn)行:(1)r MS-Ag85a-IL-17a/f的構(gòu)建及體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生:利用分子克隆技術(shù),將Ag85a-IL-17a/f基因片段克隆至穿梭表達(dá)載體p MFA42S中,構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a/f,并電轉(zhuǎn)化至恥垢分枝桿菌中,獲得r MS-Ag85a-IL-17a/f。經(jīng)Western blot鑒定蛋白表達(dá)。以重組恥垢分枝桿菌鼻腔黏膜免疫小鼠,ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗IL-17A和IL-17F自身抗體的滴度以及肺組織勻漿中IL-5、IL-12和IL-17A等細(xì)胞因子的濃度;RT-PCR法檢測(cè)肺組織中轉(zhuǎn)錄因子T-bet和GATA3的m RNA表達(dá)情況。HE染色觀察小鼠肺組織病理改變。(2)r MS-Ag85a-IL-17a的體外功能研究:r MS-Ag85a-IL-17a體外感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,以MS為對(duì)照組,觀察r MS-Ag85a-IL-17a對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡、吞噬功能的影響,Griess法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO的分泌情況,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6、MIP-1α、TNF-α、IL-10的分泌水平,RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的m RNA表達(dá)情況。(3)r MS-Ag85a-IL-17a抗哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)機(jī)制的研究:構(gòu)建小鼠哮喘模型,以r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫干預(yù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為PBS組,哮喘組,重癥哮喘組,重癥哮喘+MS組和重癥哮喘+r MS-Ag85a-IL-17a組。瑞吉染色計(jì)數(shù)小鼠肺泡灌洗液(BALF)中白細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù),并測(cè)定BALF中髓過(guò)氧化物酶(MPO)活力,HE及PAS染色觀察小鼠肺組織病理改變,ELISA法測(cè)定BALF及脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、IL-13和IL-17A的濃度,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟INF-γ+Th1細(xì)胞及IL-4+Th2細(xì)胞的含量,RT-PCR法檢測(cè)肺組織中IL-6、IL-10、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β、T-bet、GATA3和RORγt的m RNA表達(dá)情況。結(jié)果:(1)重組質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定正確,質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌獲得r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot鑒定其表達(dá)融合蛋白Ag85A-IL-17A,該融合蛋白與抗IL-17A抗體特異性結(jié)合。r MS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜免疫小鼠,可誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A自身抗體,免疫后第1周血清中開(kāi)始出現(xiàn)自身抗體,第3周到達(dá)峰值,有效滴度可維持4周以上。r MS-Ag85a-IL-17a降低小鼠肺組織勻漿中IL-5和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;上調(diào)肺組織T-bet的表達(dá)。r MS-Ag85a-IL-17f未能在小鼠體能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17F自身抗體。r IL-17F能夠增強(qiáng)小鼠肺部炎癥反應(yīng),減少肺炎鏈球菌在小鼠肺部的定植。(2)r MS-Ag85a-IL-17a增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能,促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡;提高巨噬細(xì)胞分泌NO、IL-6、MIP-1α及TNF-α的水平,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-10、Defb-2及i NOS的表達(dá)。(3)r MS-Ag85a-IL-17a干預(yù)哮喘小鼠模型,與重癥哮喘組比較,r MS-Ag85a-IL-17a顯著降低哮喘小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞及中性粒細(xì)胞的數(shù)量;降低BALF中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12的水平;降低脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-5、IL-6、IL-13和IL-17A的水平,提高IL-12、IL-10的水平;抑制BALF中MPO的活力;抑制肺組織IL-6、IL-23、Eotaxin-1、MIP-2、TGF-β和GATA3的表達(dá),上調(diào)IL-10和T-bet的表達(dá);流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示r MS-Ag85a-IL-17a提高小鼠脾臟INF-γ+Th1細(xì)胞數(shù)量,降低IL-4+Th2細(xì)胞數(shù)量;肺組織病理結(jié)果提示r MS-Ag85a-IL-17a干預(yù)組小鼠的氣道炎癥明顯減輕,炎性細(xì)胞滲出及氣道黏液分泌減少。結(jié)論:(1)成功構(gòu)建重組恥垢分枝桿菌r MS-Ag85a-IL-17a,Western blot證實(shí)其表達(dá)融合蛋白Ag85A-IL-17A。r MS-Ag85a-IL-17a能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生較高滴度的抗IL-17A自身抗體。(2)r MS-Ag85a-IL-17a加強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能,促進(jìn)細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì),增強(qiáng)巨噬細(xì)胞抗感染能力。(3)r MS-Ag85a-IL-17a經(jīng)鼻腔黏膜免疫能夠有效減輕小鼠氣道炎癥反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：重組恥垢分枝桿菌 白介素-17A 自身抗體 氣道炎癥反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R562.25
【目錄】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 縮略詞16-19
• 前言19-28
• 參考文獻(xiàn)23-28
• 第一章 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a/f構(gòu)建及體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生28-71
• 實(shí)驗(yàn)一 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a構(gòu)建及體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗體產(chǎn)生30-58
• 1 材料30-32
• 1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基30-31
• 1.2 酶、抗體、化學(xué)試劑、抗生素及試劑盒31
• 1.3 熒光定量PCR檢測(cè)用引物31-32
• 1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物32
• 1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器32
• 2 方法32-48
• 2.1 重組大腸桿菌-分枝桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a構(gòu)建及鑒定32-39
• 2.2 表達(dá)Ag85A-IL-17A的重組恥垢分枝桿菌疫苗的構(gòu)建及鑒定39-42
• 2.3 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)抗IL-17A自身抗體42-48
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析48
• 3 結(jié)果48-58
• 3.1 重組質(zhì)粒p MFA42S-Ag85a-IL-17a的構(gòu)建及鑒定48-50
• 3.2 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a的鑒定50-51
• 3.3 重組恥垢分枝桿菌與野生型恥垢分枝桿菌生長(zhǎng)曲線的比較51-52
• 3.4 Western blot鑒定Ag85A-IL-17A在重組恥垢分枝桿菌中的表達(dá)52
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜接種后對(duì)小鼠體重的影響52-53
• 3.6 rMS-Ag85a-IL-17a小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗IL-17A自身抗體53-54
• 3.7 小鼠肺組織勻漿中恥垢分枝桿菌CFU的變化54-55
• 3.8 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)小鼠肺組織勻漿中IL-5，IL-12，IL-17A表達(dá)水平的影響55
• 3.9 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)小鼠肺組織T-bet，GATA3 m RNA表達(dá)的影響55-56
• 3.10 rMS-Ag85a-IL-17a鼻腔黏膜接種后小鼠肺組織病理的改變56-58
• 實(shí)驗(yàn)二 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17f的構(gòu)建及相關(guān)功能研究58-66
• 1 材料58-59
• 1.1 菌株、質(zhì)粒、培養(yǎng)基58-59
• 1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物59
• 1.3 化學(xué)試劑及試劑盒59
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器59
• 2 方法59-60
• 2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組59-60
• 2.2 肺泡灌洗液（BALF）的收集60
• 2.3 BALF中肺炎鏈球菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù)60
• 2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析60
• 3 結(jié)果60-62
• 3.1 小鼠BALF菌落計(jì)數(shù)60-61
• 3.2 rIL-17F對(duì)小鼠BALF細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)的影響61-62
• 4 討論62-66
• 參考文獻(xiàn)66-71
• 第二章 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 功能的影響71-89
• 1 材料71-73
• 1.1 細(xì)胞系、菌株及培養(yǎng)基71-72
• 1.2 試劑盒及主要化學(xué)試劑72
• 1.3 熒光定量PCR檢測(cè)用引物72-73
• 1.4 主要實(shí)驗(yàn)儀器73
• 2 方法73-78
• 2.1 MS及rMS-Ag85a-IL-17a菌株準(zhǔn)備及RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)73-74
• 2.2 MS及rMS-Ag85a-IL-17a感染RAW264.7 細(xì)胞74-75
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清NO濃度測(cè)定（Griess法）75-76
• 2.4 ELISA法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-6，IL-10，TNF-α及MIP-1α濃度76-77
• 2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)細(xì)胞中IL-6，IL-10，Defb-2 及i NOS的表達(dá)77-78
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析78
• 3 結(jié)果78-83
• 3.1 巨噬細(xì)胞內(nèi)CFU的比較78-79
• 3.2 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡率的影響79-80
• 3.3 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)巨噬細(xì)胞分泌NO的影響80-81
• 3.4 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6，IL-10，MIP-1α 及TNF-α 表達(dá)的影響81-82
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)巨噬細(xì)胞IL-6，IL-10，Defb-2 及i NOS m RNA表達(dá)的影響82-83
• 4 討論83-85
• 參考文獻(xiàn)85-89
• 第三章 重組恥垢分枝桿菌rMS-Ag85a-IL-17a抗過(guò)敏性氣道炎癥機(jī)制研究89-123
• 1 材料89-92
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物89-90
• 1.2 菌株及培養(yǎng)基90
• 1.3 試劑盒、抗生素及主要化學(xué)試劑90-91
• 1.4 熒光定量PCR檢測(cè)用引物91
• 1.5 主要實(shí)驗(yàn)儀器91-92
• 2 方法92-101
• 2.1 菌株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備92
• 2.2 動(dòng)物免疫方案92-94
• 2.3 標(biāo)本采集及處理94-97
• 2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定97-99
• 2.5 肺組織病理學(xué)分析99-101
• 2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析101
• 3 結(jié)果101-117
• 3.1 小鼠血清中抗IL-17A自身抗體的滴度變化101-102
• 3.2 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)哮喘小鼠BALF中炎性細(xì)胞的影響102-104
• 3.3 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)哮喘小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-5，IL-6，IL-10，IL-12，IL-13 及IL-17A表達(dá)的影響104-106
• 3.4 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)哮喘小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子表達(dá)的影響106-108
• 3.5 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)小鼠BALF中髓過(guò)氧化物酶活力的影響108-109
• 3.6 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)小鼠肺組織IL-6，IL-10，IL-23，，Eotaxin-1，MIP-2，TGF-β，T-bet，GATA3和RORγt m RNA表達(dá)的影響109-110
• 3.7 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響110-111
• 3.8 rMS-Ag85a-IL-17a對(duì)哮喘小鼠脾臟Th1和Th2細(xì)胞數(shù)量的影響111-114
• 3.9 rMS-Ag85a-IL-17a黏膜免疫后小鼠肺組織病理改變114-117
• 4 討論117-120
• 參考文獻(xiàn)120-123
• 第四章 全文總結(jié)123-125
• 1 研究?jī)?nèi)容總結(jié)123
• 2 研究的創(chuàng)新點(diǎn)123-124
• 3 研究的意義及展望124-125
• 附錄：實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)基及主要試劑配方125-128
• 致謝128-129
• 攻讀博士期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文及參加科學(xué)研究項(xiàng)目情況129

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 徐苗,陳保文,沈小兵,蘇城,羅永艾,王國(guó)治;恥垢分枝桿菌作為免疫調(diào)節(jié)劑的研究[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2005年09期

2 湛W歐

本文編號(hào)：643321