發(fā)布時間：2024-05-19 17:43

　　導致嚴重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome,SARS)的新型冠狀病毒SARS-CoV可以誘導細胞凋亡。SARS-CoV Spike蛋白在介導病毒進入宿主細胞過程中發(fā)揮重要作用,對冠狀病毒的包膜形成及對病毒的出芽和胞外分泌也是必要的。研究發(fā)現(xiàn),作為SARS-CoV表面最重要的膜蛋白,SARS-CoV Spike蛋白可以誘導VeroE6細胞凋亡。目前,對SARS-CoV Spike蛋白誘導凋亡的機制研究甚少。MAPKs信號轉導通路與病毒誘導凋亡的關系是近年來研究的熱點之一。其中ERK1/2不僅與細胞增殖和分化密切相關而且參與細胞凋亡的調節(jié)。ERK1/2磷酸化下調導致了細胞生存信號的下降,進而導致了凋亡的發(fā)生。作為重要的細胞周期相關蛋白激酶途徑,ERK1/2信號途徑受到抑制是多種細胞凋亡的一個重要原因。ERK1/2, p38MAPK和JNK的動態(tài)平衡決定了細胞的存活或凋亡。 本研究證明,SARS-CoV Spike蛋白及其主要片段S318-510可以誘導VeroE6細胞凋亡。二者在早期可以通過抑制ERK1/2信號通路誘導VeroE6細胞的凋亡,...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文略語表
前言
實驗材料和方法
    1 實驗材料
        1.1 質粒
        1.2 菌株
        1.3 工具酶、酶切緩沖液及DNA Marker
        1.4 主要化學試劑
        1.5 細胞培養(yǎng)用耗材
        1.6 試劑盒
        1.7 主要儀器及設備
        1.8 主要溶液配方
            1.8.1 E.coli用培養(yǎng)基的配制
            1.8.2 制備感受態(tài)細胞相關溶液
            1.8.3 抗生素的配制
            1.8.4 大量提取質粒DNA的相關溶液
            1.8.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳緩沖液及凝膠的配制
            1.8.6 細胞凍存液的配制
            1.8.7 細胞裂解液的配制
            1.8.8 蛋白質電泳及檢測緩沖液
            1.8.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制
            1.8.10 常用緩沖液的配制
        1.9 PCR引物
        1.10 抗體
        1.11 有關RNA提取以及Northern blotting溶液的配制
        1.12 慢病毒小量包裝
    2 實驗方法
        2.1 單鏈復性
        2.2 PCR擴增
        2.3 酶切消化
        2.4 連接
        2.5 轉化
        2.6 鑒定
        2.7 感受態(tài)細胞的制備
        2.8 質粒DNA的小提
        2.9 質粒DNA的大量提取
        2.10 重組質粒DNA濃度的測定
        2.11 DNA的純化回收
        2.12 貼壁細胞培養(yǎng)
        2.13 穩(wěn)定表達細胞株的構建
        2.14 細胞凍存
        2.15 細胞復蘇
        2.16 細胞裂解
        2.17 DNA ladder分析
        2.18 Annexin-V/PI雙染流式分析測定早期細胞凋亡
        2.19 總RNA的提取及定量
            2.19.1 組織勻漿
            2.19.2 總RNA的抽提
            2.19.3 總RNA的沉淀
            2.19.4 總RNA的洗滌和溶解
            2.19.5 總RNA的檢測
        2.20 Northern blotting實驗
            2.20.1 探針的制備與純化
            2.20.2 甲醛變性電泳凝膠制備
            2.20.3 樣品處理
            2.20.4 轉膜
            2.20.5 預雜交
            2.20.6 雜交
            2.20.7 洗膜
            2.20.8 信號檢測
            2.20.9 探針去除及雜交參照基因Actin
        2.21 慢病毒包裝實驗
        2.22 病毒的收獲及濃縮
        2.23 RNA干擾有效靶點篩選實驗—RT-PCR篩靶
        2.24 Annexin V/PI雙染
        2.25 Western Blotting的檢測方法
        2.26 蛋白提純
結果
    3.1 優(yōu)化S蛋白,并合成S蛋白基因
    3.2 將CD5L插入載體,構建PEAK13 CD5L Fc質粒
    3.3 構建S及其片段基因的克隆,并檢測
    3.4 瞬時轉染P13 CD5L S1190 Fc,檢測在VeroE6細胞中的蛋白表達
    3.5 SARS-CoV Spike蛋白引起細胞凋亡的形態(tài)改變
    3.6 FACS檢測早期凋亡的細胞
    3.7 轉染P13 CD5L S1190 Fc質粒誘導VeroE6細胞凋亡的DNA Ladder
    3.8 加入純化的SARS-CoV 1190 Fc蛋白誘導VeroE6細胞凋亡
    3.9 轉染P13 CD5L S1190 Fc質粒誘導HEK293細胞的PARP剪切實驗
    3.10 SARS-CoV Spike蛋白的各個片段誘導凋亡的情況
        3.10.1 轉染SARS-CoV S各不同片段質粒剪切PARP實驗
        3.10.2 SARS-CoV S317 Fc不能誘導凋亡
        3.10.3 SARS-CoV S318-510蛋白可以誘導凋亡
            3.10.3.1 轉染P13 CD5L S318-510 Fc質粒誘導的DNA Ladder
            3.10.3.2 加入SARS-CoV S318-510 Fc蛋白誘導的DNA Ladder
            3.10.3.3 FACS
        3.10.4 轉染P13 CD5L S681-1190 Fc質�？梢哉T導VeroE6細胞凋亡
    3.11 SARS-CoV Spike蛋白凋亡早期下調Bcl-2,上調Bax
    3.12 SARS-CoV Spike蛋白早期抑制ERK1/2信號通路
        3.12.1 轉染P13 CD5L S1190 Fc質粒早期抑制ERK1/2信號通路
        3.12.2 加入純化的SARS-CoV S1190 Fc蛋白誘導VeroE6細胞ERK1/2磷酸化信號的下調
    3.13 轉染P13 CD5L S1190 Fc早期沒有引起p38MAPK和JNK信號磷酸化水平的改變
    3.14 轉染P13 CD5L S1190 Fc質粒早期引起凋亡相關的下游重要信號分子磷酸化的改變
    3.15 SARS-CoV S318-510蛋白也可以通過抑制ERK1/2信號通路誘導凋亡
    3.16 STAT3上游信號JAK1,JAK2,Tyk2磷酸化水平沒有改變
    3.17 SARS-CoV Spike蛋白和SARS-CoV S318-510蛋白早期沒有引起AKT信號改變
    3.18 SARS-CoV spike蛋白可以在蛋自及mRNA水平下調ACE2的表達
        3.18.1 SARS-CoV S1190 Fc蛋白引起受體ACE2下調實驗
        3.18.2 Northern blotting檢測野生型C57小鼠肺臟和腎臟中ACE2的表達
            3.18.2.1 小鼠肺臟和腎臟總RNA質量的檢測
            3.18.2.2 檢測小鼠肺臟和腎臟ACE2 mRNA表達水平
            3.18.2.3 SARS-CoV Spike蛋白下調VeroE6細胞ACE2 mRNA表達水平
    3.19 構建慢病毒感染的ACE2敲除的VeroE6永久細胞株(ACE2 RNAi VeroE6)
        3.19.1 目的基因RNA干擾慢病毒載體制備
        3.19.2 目的基因RNA干擾陽性克隆質粒抽提瓊脂糖凝膠電泳圖譜
        3.19.3 RT-PCR檢測目的基因的mRNA表達水平
        3.19.4 構建慢病毒感染的ACE2 RNAi和NC RNAi的VeroE6永久細胞株
    3.20 檢測SARS-CoV Spike蛋白在ACE2 RNAi VeroE6和Nc RNAi VeroE6細胞凋亡中的作用
        3.20.1 流式細胞儀PI單染法
        3.20.2 DNA ladder法檢測細胞凋亡
討論
小結
參考文獻
論文綜述
    參考文獻
附錄
致謝



本文編號：3978237