本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細(xì)胞凍存前后生物學(xué)特性比較及其對(duì)脂多糖致肺損傷干預(yù)作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 1、液氮深低溫保存人羊膜上皮細(xì)胞（human Amniotic Epithelial Cells，hAECs）是否會(huì)對(duì)其干細(xì)胞活性產(chǎn)生影響，相關(guān)報(bào)道較少見(jiàn)。本研究從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生長(zhǎng)狀況、細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物及干細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞體外成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞多向誘導(dǎo)分化四個(gè)方面，來(lái)觀察hAECs凍存前后的生物學(xué)活性和干細(xì)胞特性，以研究液氮深低溫保存hAECs的可靠性。 2、膿毒血癥仍然是導(dǎo)致急性肺損傷（acute lung injury，ALI）最常見(jiàn)的原因，目前尚缺乏十分有效的治療手段。本研究通過(guò)檢測(cè)肺組織病理學(xué)切片、肺組織和血清中細(xì)胞因子的變化，來(lái)觀察hAECs對(duì)內(nèi)毒素性肺損傷的干預(yù)作用及其可能機(jī)制，以探討人羊膜上皮細(xì)胞治療急性肺損傷的可行性。 方法： 1、取健康產(chǎn)婦足月剖宮產(chǎn)后胎盤的羊膜組織，采用多次胰酶消化法獲取hAECs，培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)多次差別消化法逐步純化hAECs。調(diào)整純化的第2代（P2）細(xì)胞密度至5×106/mL，向細(xì)胞中緩慢加入新鮮配制的二甲基亞砜（DMSO）凍存液。將凍存管置于程序降溫儀中，待溫度降至-100℃后迅速移入液氮罐中保存。1個(gè)月后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察凍存前后hAECs的形態(tài)變化及增殖情況；并用流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物（CD29、CD73、CD166、CD44、CD90、HLA-ABC、CD34）；用RT-PCR法檢測(cè)Oct-4及Nanog干細(xì)胞基因表達(dá)；同時(shí)在體外誘導(dǎo)hAECs向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞分化。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法分析兩組間的差異。 2、向新生SD大鼠腹腔內(nèi)注射大腸桿菌內(nèi)毒素溶液20μL/g(5mg/kg)，制備脂多糖致急性肺損傷的動(dòng)物模型。造模后2h經(jīng)氣管滴入CM-Dil熒光標(biāo)記好的P2代hAECs。動(dòng)物隨機(jī)分組如下：（A）正常組（n=5）；（B）模型組（LPS）（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg；（C）細(xì)胞組（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注hAECs（5×105個(gè)cells/40μL）；（D）對(duì)照組（n=5）：腹腔內(nèi)注射LPS5mg/kg+氣管內(nèi)滴注40μLPBS液。分別在輸注細(xì)胞24h、72h后，處死動(dòng)物收取標(biāo)本，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各5只大鼠。取肺組織標(biāo)本固定，HE染色后觀察肺損傷程度，測(cè)量肺損傷病理評(píng)分、肺泡間隔的厚度，測(cè)量肺干濕比（D/W）。用ELISA免疫吸附法檢測(cè)肺組織丙二醛（MDA）濃度和超氧化物歧化酶（SOD）活性、同時(shí)檢測(cè)血清中白介素10（IL-10）和白介素6（IL-6）的濃度。數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x s）表示，用單因素方差分析法分析組間差異。 結(jié)果： 1、hAECs凍存前后的形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改變，均呈鋪路石樣膜狀生長(zhǎng)。與凍存前細(xì)胞相比，凍存后hAECs傳代時(shí)所需的消化時(shí)間有所縮短（P0.05），但細(xì)胞活率、傳代時(shí)間、培養(yǎng)代數(shù)無(wú)明顯改變。凍存前后細(xì)胞生長(zhǎng)曲線均呈S型，凍存后細(xì)胞與凍存前細(xì)胞的生長(zhǎng)周期相比，細(xì)胞經(jīng)歷滯留期、對(duì)數(shù)期和平臺(tái)期的時(shí)間無(wú)明顯差異。 2、凍存后hAECs仍可以表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記，CD73、CD29、CD166陽(yáng)性率達(dá)90%以上，中度表達(dá)CD90、CD44，低表達(dá)I類白細(xì)胞抗原(HLA-ABC)，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34。RT-PCR法檢測(cè)Oct-4及Nanog基因表達(dá)均呈陽(yáng)性。體外誘導(dǎo)后，凍存前后的hAECs均可向成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞分化。 3、腹腔內(nèi)注射LPS后，肺組織可見(jiàn)不同程度充血、血管內(nèi)皮損傷出血，部分肺泡萎陷不張，部分肺泡間隔增厚、破壞。模型組與正常組相比，肺損傷病理評(píng)分、肺泡間隔的厚度均有顯著增加（P0.01）、肺干濕比減低（P=0.04）。檢測(cè)肺組織和血清中的生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)， MDA濃度有所升高伴SOD活性減低，模型組與正常組比較，兩者的變化都尚未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。模型組血清中促炎癥因子IL-6水平逐漸升高，抗炎因子IL-10的水平逐漸減低，與正常組相比，IL-6水平24h為1.25±0.01（P=0.762），72h為1.61±0.29（P=0.006）；IL-10的水平24h為13.68±1.14（P=0.219），72h為12.49±0.40（P=0.005），兩種因子在血清中的濃度變化72h時(shí)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 4、輸入hAECs細(xì)胞后，細(xì)胞組與對(duì)照組相比，24h和72h時(shí)肺損傷評(píng)分、肺泡間隔厚度均有顯著降低（P0.01），差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞組中肺干濕比（D/W值）與對(duì)照組相比有所升高，24h時(shí)P=0.046，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72h時(shí)P=0.366差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞組氧化因子MDA的濃度在肺組織中逐漸減低，抗氧化因子SOD活性逐漸升高，與對(duì)照組對(duì)比，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞組中促炎癥因子IL-6水平降低，抗炎因子IL-10水平升高，與對(duì)照組相比72h時(shí)P0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、凍存后的hAECs除細(xì)胞貼壁性有所下降外，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)周期、細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)記及其多向分化的潛能均沒(méi)有改變，說(shuō)明液氮深低溫保存不影響hAECs的生物學(xué)特性，可以成為保存hAECs的一個(gè)可靠方法。 2、氣管內(nèi)輸入hAECs后，肺組織損傷評(píng)分減少、肺泡間隔的厚度縮小，肺水腫減輕，說(shuō)明可以hAECs可以減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，減輕肺泡滲出，對(duì)內(nèi)毒素導(dǎo)致的ALI具有修復(fù)作用。 3、hAECs能夠通過(guò)減輕局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，調(diào)節(jié)促炎因子和抗炎因子的平衡，減輕炎癥反應(yīng)，保護(hù)受損組織，促進(jìn)組織恢復(fù)
【關(guān)鍵詞】：羊膜上皮細(xì)胞 多能性 深低溫保存 脂多糖 急性肺損傷
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R563
【目錄】：

• 主要符號(hào)表5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-17
• 第一部分 人羊膜上皮細(xì)胞凍存前后生物學(xué)特性的比較17-30
• 材料及方法17-23
• 1 實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)器材17
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 1.4 實(shí)驗(yàn)試劑濃度的配制19
• 2 實(shí)驗(yàn)方法19-23
• 2.1 人羊膜上皮細(xì)胞的收集、培養(yǎng)19-20
• 2.2 人羊膜上皮細(xì)胞的傳代培養(yǎng)20
• 2.3 人羊膜上皮細(xì)胞的凍存20
• 2.4 人羊膜上皮細(xì)胞的復(fù)蘇20-21
• 2.5 細(xì)胞增殖動(dòng)力學(xué)分析21
• 2.6 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物21
• 2.7 人羊膜上皮細(xì)胞的鑒定21
• 2.8 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)21-23
• 2.9 向成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化23
• 2.10 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化23
• 結(jié)果23-27
• 1 人羊膜上皮細(xì)胞凍存前后的培養(yǎng)及擴(kuò)增23-25
• 2 人羊膜上皮細(xì)胞凍存前后生物學(xué)性狀分析25-27
• 討論27-30
• 第二部分 人羊膜上皮細(xì)胞對(duì)脂多糖致肺損傷的干預(yù)研究30-41
• 材料及方法30-35
• 1 實(shí)驗(yàn)材料30-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-35
• 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理35
• 結(jié)果35-38
• 1 人羊膜上皮細(xì)胞在肺內(nèi)的情況35
• 2 評(píng)價(jià)細(xì)胞輸入前后肺組織炎癥程度35-37
• 3 細(xì)胞輸入后肺組織中細(xì)胞因子水平檢測(cè)37
• 4 細(xì)胞輸入后血清中細(xì)胞因子水平檢測(cè)37-38
• 討論38-41
• 總結(jié)41-42
• 附圖42-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 綜述54-64
• 參考文獻(xiàn)60-64
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果64-65
• 致謝65-66

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 黃友章;沈建良;宮立眾;鄭培浩;劉毅;尹文杰;岑堅(jiān);王寧;趙德峰;;骨髓細(xì)胞液氮保存21-25年后的細(xì)胞活力體外研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2010年01期

  本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細(xì)胞凍存前后生物學(xué)特性比較及其對(duì)脂多糖致肺損傷干預(yù)作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：360956