本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香煙誘導肺纖維化中的調(diào)節(jié)作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的：吸煙是引發(fā)慢性阻塞性肺部疾病(Chronic obstructive pulmonary diseases, COPD)的主要危險因素。香煙含有大量的氧化物質(zhì),這些氧化物能激活蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2(protein tyrosine phosphatase, Shp2)。Shp2是一種由PTPNII基因編碼的蛋白酪氨酸磷酸酶,含有2個SH結(jié)構(gòu)域,其作為細胞因子、生長因子及其他胞外刺激因素的下游信號分子廣泛地表達于機體各種組織和細胞中,參與細胞增殖、分化、死亡等諸多細胞生命活動環(huán)節(jié)。我們之前研究證明吸煙和香煙煙霧提取物(Cigarette smoke extract,CSE)能夠激活人上皮細胞Shp2mRNA和蛋白的表達,Shp2抑制劑干預和肺上皮細胞Shp2基因敲除小鼠或細胞可減輕吸煙誘導的肺部炎癥反應與上皮細胞炎癥因子表達。本課題中我們探討抑制和基因敲除Shp2減輕吸煙誘導小鼠肺纖維化的作用及機制。 方法： 1、整體實驗：觀察Shp2特異性抑制劑PHPS1干預和肺上皮細胞Shp2基因敲除小鼠對吸煙引起的肺纖維化指標的影響。小鼠每天吸煙10支,連續(xù)10天,誘導肺纖維化模型,檢測指標包括轉(zhuǎn)錄生長因子β1(Transforming growth factor-β1, TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproleinase-9, MMP-9)、鈣結(jié)合蛋白(Calcium binding protein, S100A4),膠原纖維沉積以及Shp2表達。 1)收集肺泡灌洗液(BALF),采用酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)法檢測BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白表達； 2)收集肺組織,制備勻漿上清液,采用定量多聚合酶鏈反應(Q-PCR)法測定勻漿上清液中MMPs和TGF-β1基因的表達； 3)制作肺組織切片,采用免疫組化染色法檢測小氣道周圍Shp2、MMP-9和S100A4表達； 4)肺組織切片,采用Masson膠原纖維染色法檢測小氣道周圍膠原纖維沉積。 2、離體實驗：觀察Shp2特異性抑制劑PHPS1處理肺上皮細胞和Shp2基因沉默肺上皮細胞對CSE誘導的MMP-9和TGF-β1表達的影響,以及對信號分子的影響。 香煙煙霧提取物(CSE)刺激小鼠正常肺上皮細胞MLE-12： 1)采用MTT法測定MLE-12細胞活性； 2) Western blot (WB)法檢測CSE誘導p-Shp2和Shp2表達； 3)CSE刺激MLE-12細胞,Q-PCR法檢測MMPs基因表達,WB法檢測MMP-9蛋白表達； 4)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預細胞后進行CSE刺激,采用Q-PCR和WB法檢測Shp2對CSE誘導MMP-9基因和蛋白的影響； 5)Shp2siRNA沉默Shp2基因后進行CSE刺激,采用WB法檢測Shp2對CSE誘導MMP-9的調(diào)節(jié)作用。 香煙煙霧提取物(CSE)刺激人肺泡Ⅱ型上皮細胞A549： 6)CSE刺激A549細胞,半定量多聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Elisa法檢測TGF-β1基因和蛋白表達； 7)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預A549細胞后進行CSE刺激,采用Q-PCR法檢測Shp2對CSE誘導TGF-β1基因表達的影響； 8)作用機制研究：預先給予Erk1/2抑制劑U0126, JNK抑制劑SP600125,p38抑制劑SB203580阻斷Erk1/2, JNK和p38的活性,CSE刺激MLE-12細胞后,Q-PCR和WB法檢測CSE誘導MMP-9表達,研究分析其可能的作用機制。 結(jié)果： 1、整體實驗： 1)小鼠經(jīng)香煙煙霧暴露10天后,肺泡與小氣道上皮細胞的Shp2表達顯著增高； 2) BALF上清中MMP-9及TGF-β1的蛋白表達顯著性增強；肺組織中MMP-9和TGF-β1基因水平表達明顯升高；肺組織MMP-9、S100A4的表達量以及膠原纖維沉積明顯升高； 3)與對照組小鼠相比,煙霧暴露小鼠經(jīng)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預后,BALF上清中MMP-9、TGF-β1的蛋白表達顯著性下降；肺組織勻漿MMP-9和TGF-β1的基因表達水平亦明顯降低,肺MMP-9、S100A4表達量以及膠原纖維沉積明顯減少； 4)肺上皮細胞Shp2基因敲除小鼠與對照組小鼠相比,BALF上清中MMP-9和TGF-β1蛋白釋放顯著性下降,肺組織勻漿中MMP-9和TGF-β1的基因水平表達明顯降低,肺MMP-9、 S100A4的表達量以及膠原纖維沉積同樣明顯減少。 2、離體實驗： 1)細胞活力檢測中,不同濃度的CSE(0.5%～5%)與肺上皮細胞MLE-12分別培養(yǎng)24、48、72h,呈濃度和時間依賴引起MLE-12細胞損傷,細胞的存活率下降； 2)CSE呈濃度依賴誘導MLE-12細胞Shp2基因和蛋白表達以及誘導Shp2磷酸化表達； 3)CSE呈濃度和時間依賴誘導MLE-12細胞表達MMP-9基因和蛋白； 4)Shp2特異性抑制劑PHPS1抑制CSE誘導的MLE-12細胞表達MMP-9基因和蛋白； 5)MLE-12細胞Shp2基因沉默后能顯著減少CSE誘導表達MMP-9蛋白； 6)CSE刺激人肺泡Ⅱ型上皮細胞A549,呈濃度和時間依賴誘導A549細胞表達TGF-β1基因和蛋白； 7)Shp2特異性抑制劑PHPS1抑制CSE誘導A549細胞表達TGF-β1基因； 8)CSE可誘導MLE-12細胞JNK和p38信號蛋白的磷酸化,對Erkl/2和Akt信號蛋白磷酸化無明顯影響。JNK抑制劑SP600125能顯著抑制CSE誘導的肺上皮細胞MMP-9釋放,PHPS1能顯著降低由CSE誘導的肺上皮細胞JNK磷酸化。 結(jié)論： 1)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預小鼠或?qū)⑿∈蠓紊掀ぜ毎鸖hp2基因敲除均可顯著減輕 吸煙引起的肺纖維化； 2)Shp2特異性抑制劑PHPS1干預肺上皮細胞或?qū)⒎紊掀ぜ毎鸖hp2基因沉默均可顯著減 少CSE誘導的MMP-9和TGF-β1表達。 3) Shp2/JNK信號通路可能是吸煙誘導小鼠肺纖維化的信號轉(zhuǎn)導機制。 本研究結(jié)果提示Shp2是香煙煙霧引發(fā)肺纖維化可能的潛在靶點。
【關(guān)鍵詞】：Shp2 吸煙 COPD 肺纖維化 MMP-9 TGF-β1
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 摘要2-5
• Abstract5-7
• 符號說明7-9
• 1、引言9-12
• 2、材料與方法12-22
• 2.1 材料12-15
• 2.2 方法15-21
• 2.3 統(tǒng)計學分析21-22
• 3、整體實驗結(jié)果22-29
• 3.1、吸煙對小鼠肺組織Shp2表達的影響22
• 3.2、吸煙對小鼠肺纖維化指標的影響22-24
• 3.3、PHPS1對小鼠肺纖維化模型的影響24-26
• 3.4、肺上皮細胞Shp2基因敲除對吸煙小鼠肺纖維化指標的影響26-28
• 整體實驗小結(jié)28-29
• 4、離體實驗結(jié)果29-37
• 4.1、香煙提取物CSE對肺上皮細胞的影響29-33
• 4.2、Shp2特異性抑制劑PHPS 1對CSE誘導肺上皮細胞表達MMP-9和TGF-β1基因與蛋白的影響33-34
• 4.3、Shp2基因沉默肺上皮細胞對CSE誘導MLE-12細胞表達MMP-9蛋白的影響34-35
• 4.4、Shp2對香煙煙霧誘導肺纖維化機制研究35-36
• 離體實驗小結(jié)36-37
• 5、討論37-40
• 6、下一步工作展望40-41
• 參考文獻41-46
• 綜述46-50
• 參考文獻49-50
• 致謝50-51
• 作者簡歷及在讀期間所發(fā)表的論文51-52

【共引文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：蛋白酪氨酸磷酸酶Shp2在香煙誘導肺纖維化中的調(diào)節(jié)作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：329366