本文關鍵詞：線粒體DNA抑制脂多糖誘導的肺部炎癥反應及相關機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：一、 研究背景在美國,創(chuàng)傷是青年的頭號死亡原因。盡管一些患者可以在創(chuàng)傷的早期幸存,但是他們往往需要面臨另一個挑戰(zhàn),即肺部感染和急性呼吸窘迫綜合癥。(Acute respiratory disease syndrome,ARDS)。ARDS的發(fā)病機制涉及多個環(huán)節(jié),既往研究在ARDS發(fā)生發(fā)展機制領域取得了一些進展,但其具體機制目前仍然沒有完全闡明。ARDS的核心機制是全身炎癥反應綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS),各種致傷因子通過SIRS導致ARDS。在對以SIRS為核心的ARDS發(fā)生機制的研究中發(fā)現(xiàn)：感染和非感染的刺激可以分別通過病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)作用于模式識別受體(pattern recognition Receptors,PRRs),繼而促進炎性細胞因子的表達和分泌,介導瀑布式炎癥反應,最終導致ARDS的發(fā)生。過去的研究顯示,創(chuàng)傷后呼吸機相關肺炎(ventilator-associated pneumonia,VAP)與高死亡率和ICU住院時間延長有關。雖然我們目前已發(fā)現(xiàn)嚴重的損傷和受損的免疫反應相關,但是對損傷引起的免疫抑制的原因及機制還知之甚少。DAMPs/PAMPs作用于PRRs在IL-1β的合成和釋放中扮演重要角色。目前已發(fā)現(xiàn)的PRRs主要分為以下三類：Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)、 RIG-I樣受體(retinoic acid-inducible gene-I [RIG-I]-like receptors,RLRs)和NOD樣受體(nucleotide binging oligomerization domain[NOD]-like receptors, NLRs)。胞外刺激物主要是通過TLRs作用于細胞介導信號轉導的。到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了13種TLRs,它們中的大部分被深入研究并且發(fā)現(xiàn)它們各自的配體。像TLR-2介導識別包括脂蛋白、脂肽、脂磷壁酸等微生物成分。TLR-9主要被含有CpGDNA的細菌,一些雙鏈DNA病毒和人工合成的CpG核苷酸刺激。巨噬細胞在誘導和調節(jié)肺部炎癥時的免疫反應中起到重要作用。它能識別病原微生物并分泌TNF-a,IL-6 and IL-1β等促炎因子。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是革蘭陰性桿菌細胞壁的重要組成部分,重要的PAMPs,可以作用于巨噬細胞,通過NF-kB介導炎癥因子的合成和釋放。LPS耐受,是指機體接受小劑量LPS刺激后,對LPS的再刺激表現(xiàn)出低反應的現(xiàn)象。這種現(xiàn)象常常在創(chuàng)傷后期免疫抑制繼發(fā)膿毒血癥的患者中發(fā)現(xiàn)。近年來,我們對LPS耐受機制和LPS再刺激誘導的巨噬細胞敏感性降低的認識不斷提高,對LPS的信號通路也有了更為深刻的理解。廣義的內毒不特指LPS的預刺激所誘發(fā)的對LPS的耐受。研究表明LPS是通過眾多PRRs中的TLR4啟動信號轉導的。研究發(fā)現(xiàn),不同微生物刺激通過不同的TLR介導。而且研究還發(fā)現(xiàn),除了TLR4配體,其他TLRs的刺激物預處理巨噬細胞也可以產生對LPS的交互耐受。目前已經報道的有TLR-2, TLR-4, TLR-5,TLR-9,它們能誘導對同種刺激物再刺激的低反應。除此之外,還發(fā)現(xiàn)通過TLR-2和TLR4以及TLR-4和TLR-9的刺激物可以相互替代,誘導交互耐受的發(fā)生。線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)與核DNA(bDNA)起源和進化有很大差異。目前主流學說認為線粒體DNA來源于細菌DNA,它在體內與真核生物共生最終進化而成細胞器。與細菌DNA一樣,mtDNA富含去甲基化的CpG序列,可以激活機體產生炎癥反應。因此,mtDNA作為重要的DAMPs,其致炎機制也備受關注。目前的文獻資料顯示,CpG單核苷酸通過TLR9受體,介導絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)磷酸化上調NF-kB而進一步誘導炎癥反應。在不同類型細胞中,CpG單核苷酸作用于相應的MAPKs并刺激不同的下游炎癥因子或趨化因子的產生。MAPK級聯(lián)激活是多種信號通路的中心,是接收膜受體轉換與傳遞的信號并將其帶入細胞核內的一類重要分子。在未受刺激的細胞內,MAPK處于靜止狀態(tài)。當細胞受到生長因子或其他因素刺激后,MAPK接到MAPK激酶激酶和MAPK激酶的活化信號后被激活,表現(xiàn)為逐級磷酸化。而且,p38MAPK還是LPS誘導的炎癥反應中的重要因子。mtDNA預處理會對LPS刺激誘導的p38 MAPK有什么影響,目前還無相關研究結果說明。近年來,學者們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷、休克等釋放的內源性mtDNA可以作為重要的DAMPs通過TLR9作用于巨噬細胞。新近有研究發(fā)現(xiàn),肺部損傷可以引起中性粒細胞向肺部轉移,而向腹腔內注射mtDAMPs可以刺激腹部創(chuàng)傷,同時誘發(fā)中性粒細胞聚集。但是此時肺部中性粒細胞轉向腹部移動,腹腔內注射mtDAMPs并沒有和中性粒細胞協(xié)同刺激肺部炎癥,反而使得肺部中性粒細胞移除肺組織。當從損傷、死亡或壞死組織釋放時,中性粒細胞向肺部感染趨化的正常反應會減弱,提示肺部的趨化因子可能下降。這使得肺的免疫防御能力下降,更容易受到病原體損害。這種新機制的發(fā)現(xiàn)可能可以解釋系統(tǒng)組織創(chuàng)傷、肺炎和膿毒血癥的關系。這種線粒體DAMPs預處理抑制繼發(fā)于肺挫傷的肺部炎癥反應的發(fā)現(xiàn)提示mtDNA可能通過某種機制誘導免疫抑制。二、研究目的目前mtDNA對LPS的交互耐受作用尚不明確,本研究通過體內和體外實驗探索mtDNA對LPS誘導的肺部炎癥反應的抑制作用,闡明mtDNA預處理對LPS的耐受作用,對mtDNA在炎癥反應中的作用進行深入探索,以期輔助炎性疾病的診治。三、研究方法1、外源性mtDNA的獲得：培養(yǎng)THP-1細胞,收集并提取THP-1細胞的mtDNA;取小鼠肝臟,充分研磨提取鼠mtDNA。并用分光光度計檢測其濃度,并用熒光實時定量PCR(real-timePCR, RT-PCR)檢測核基因GAPDH(人),18S(鼠),排除可能混雜核基因感染的干擾。2、刺激分化的THP-1細胞并檢測：先用PMA處理細胞24h,誘導細胞分化。用不同濃度的ntDNA(0.1ug/ml,1 ug/ml, 5 ug/ml,10 ug/ml,20 ug/ml)或1640培養(yǎng)基預處理分化的THP-1細胞2h或24h,后給予LPS (100ng/ml)刺激3h。通過ELISA試劑盒檢測細胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)的變化。用最適ntDNA濃度刺激THP-1預處理細胞,再給予LPS(100ng/ml)刺激。通過RT-PCR檢測細胞中炎癥因子的mRNA表達情況。3. mtDNA刺激對LPS介導的p38 MAPK激活的影響：借助Westren Blot方法檢測mtDNA預處理和LPS再刺激前后,p38 MAPK的蛋白水平及磷酸化的差異。4、mtDNA預處理對LPS誘導的C57BL/6小鼠肺部炎癥的影響：將36只小鼠隨機分四組分別給予生理鹽水、LPS、mtDNA、mtDNA+LPS刺激,mtDNA腹腔注射刺激,通過氣管內給藥的方式給予小鼠LPS(100ug/kg)刺激。LPS處理3h后處死小鼠,取肺組織。通過HE染色和免疫熒光觀察各組的肺組織病理變化,對比炎癥反應輕重；測量肺濕干比。將肺組織研磨均勻,蛋白酶溶解并收集組織上清,用ELISA試劑盒檢測各組的促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的蛋白水平。統(tǒng)計分析各組結果。四、實驗結果1、mtDNA預處理誘導巨噬細胞對LPS的耐受：分化的THP-1細胞在不同濃度的mtDNA預處理24h,再受到LPS刺激后,釋放的炎癥因子TNF-a (5ug/ml mtDNA)、IL-1β(5ug/ml mtDNA)、IL-6(lOug/ml mtDNA)水平都下降了,而IL-8的蛋白水平變化無統(tǒng)計學差異。該結果表明mtDNA預處理可以抑制LPS誘導的炎癥因子釋放。而不同濃度mtDNA預處理2h后給予LPS再刺激,各細胞因子的釋放增加,此時mtDNA和LPS表現(xiàn)出協(xié)同效應。RT-PCR結果顯示,mtDNA 10ug/ml預處理THP-1細胞24h后,再給予LPS刺激可使LPS誘導的炎癥因子(TNF-a,IL-1β and IL-6)基因表達水平下降,而IL-8的基因水平無明顯變化。這個結果和細胞培養(yǎng)上清蛋白釋放結果一致。2.P38 MAPK在mtDNA誘導的LPS耐受中的作用：我們既往的研究結果發(fā)現(xiàn),mtDNA可以激活中性粒細胞的TLR9-p38 MAPK通路誘導無菌炎癥和ALI。而且P38 MAPK已被證實是LPS誘導的炎癥反應中的重要因子。我們通過Western Blot技術檢測小鼠肺組織的p38蛋白水平發(fā)現(xiàn),單獨給予mtDNA或LPS刺激都可以顯著誘導P38 MAPK上調和磷酸化,而對比未添加預處理的THP-1細胞,給予LPS刺激誘導的p38磷酸化在mtDNA預處理組顯著被抑制了。3、mtDNA預處理抑制LPS誘導的小鼠肺部炎癥：通過觀察4組小鼠的肺組織病理發(fā)現(xiàn),LPS組的小鼠肺部炎癥最重,mtDNA+LPS組小鼠的肺部炎癥較LPS組減輕,提示mtDNA預處理對LPS誘導的肺部炎癥有抑制作用。通過比較各組小鼠肺的濕干比發(fā)現(xiàn),LPS處理組肺濕干比最大,而組mtDNA+LPS組有所減小。此外,我們還對肺組織研磨上清進行ELISA檢測,結果發(fā)現(xiàn),mtDNA預處理可以顯著降低LPS誘導的TNF-a和IL-6釋放,但IL-1p和IL-8的釋放無明顯改變。五、結論：我們的研究表明mtDNA預處理THP-1細胞可以抑制LPS誘導的炎癥因子表達和釋放,導致細胞的LPS耐受效應的產生。而且,我們的結果還提示p38MAPK在mtDNA和LPS的交互耐受中有重要的作用。內毒素耐受既可以降低過度炎癥反應,減少機體損傷；又可能導致免疫抑制,增加二次感染的風險。內毒素耐受及其與刺激物之間的量化關系,對診治炎癥相關疾病有重要的作用。我們將在未來的研究中進行更為廣泛和深入的探索
【關鍵詞】：mtDNA LPS LPS耐受 TLRs
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R563
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 參考文獻18-20
• 第一章 mtDNA預處理抑制LPS誘導的THP-1細胞炎癥因子表達和釋放20-40
• 1. 實驗材料和方法20-32
• 1.1 實驗材料20-22
• 1.2 實驗方法22-32
• 1.3 統(tǒng)計分析32
• 2. 實驗結果32-36
• 2.1 mtDNA預處理誘導巨噬細胞對LPS的交互耐受32-35
• 2.2 P38 MAPK在mtDNA誘導的LPS耐受中的作用35-36
• 3. 討論36-38
• 參考文獻38-40
• 第二章 mtDNA抑制LPS誘導的小鼠肺部炎癥反應40-54
• 1. 實驗材料和方法40-45
• 1.1 實驗材料40-41
• 1.2 實驗方法41-45
• 1.3 統(tǒng)計分析45
• 2. 實驗結果45-49
• 2.1 mtDNA預處理可以抑制LPS誘導的小鼠肺組織炎癥45-47
• 2.2 mtDNA預處理降低LPS誘導的小鼠肺濕干比升高47-48
• 2.3 mtDNA抑制LPS誘導的小鼠肺組織細胞因子的釋放48-49
• 3. 討論49-52
• 參考文獻52-54
• 全文總結54-56
• 文獻綜述：線粒體相關的NLRP3炎性體激活56-64
• 參考文獻61-64
• 附錄64-66
• 成果66-67
• 致謝67-68

【共引文獻】

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  本文關鍵詞：線粒體DNA抑制脂多糖誘導的肺部炎癥反應及相關機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：328431