本文關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞吞噬功能減退及其機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景及目的 慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種以持續(xù)存在的呈進行性發(fā)展的氣流受限為特征的常見疾病,伴有氣道和肺對有害顆�；驓怏w所致慢性炎癥反應的增加。氣道、肺實質(zhì)及肺血管的慢性炎癥是COPD的特征性改變,多種炎癥細胞(如中性粒細胞、巨噬細胞等)參與了COPD的發(fā)病過程。越來越多的研究資料表明,嚴重的COPD患者存在發(fā)生侵襲性肺曲霉病(IPA)的高風險。 曲霉是一種條件致病菌,對于免疫功能正常的人,曲霉孢子吸入人體后可以被天然免疫系統(tǒng)清除；但是免疫功能低下的病人,曲霉孢了吸入在肺部后,可以在肺部大量繁殖,在一定條件下導致肺部的侵襲性感染并可隨血循環(huán)播散到其他器官,甚至可能導致死亡。研究資料表明,COPD是ICU患者曲霉感染重要的危險因素。有學者認為大劑量使用糖皮質(zhì)激素、合并基礎疾病、反復運用廣譜抗生素、肺功能III級以上、營養(yǎng)不良等因素可能增加COPD患者曲霉感染的風險,但這種觀點缺乏大量相關(guān)的研究資料來佐證。而本實驗室前期的臨床研究資料表明,COPD患者穩(wěn)定期全身使用糖皮質(zhì)激素、住院期間使用三種以上抗生素、以及抗生素使用時間大于10d是發(fā)生IPA的相關(guān)獨立危險因素。COPD患者曲霉易感性增加的具體機制尚不清楚,可能與機體防疫功能的減退——尤其是與巨噬細胞吞噬功能的減退有關(guān)。 國內(nèi)外大量的研究表明,長期吸煙可能影響AM (alveolar macrophages,AM)功能,導致肺的免疫功能受損,從而使COPD患者呼吸系統(tǒng)細菌定植以及肺部感染發(fā)生率增高。肺泡巨噬細胞是機體的第一道防線,在清除煙曲霉分生孢子的過程中扮演著重要的角色。巨噬細胞要通過吞噬作用與殺滅作用才能將曲霉孢子清除,吞噬作用作為清除過程的首要步驟,就顯得尤為重要。巨噬細胞發(fā)揮吞噬作用需依賴其表面的模式識別受體(Pathogen recognition receptors, PRRs)對曲霉孢子的識別。在所有相關(guān)的PRRs中,與曲霉分生孢子關(guān)系較為密切的是Toll樣受體(Toll Like Receptors, TLRs)其中,TLR2是TLRs中與煙曲霉關(guān)系最為密切的一種。它能識別煙曲霉PAMP,如β-葡聚糖、角質(zhì)素、肽聚糖、甘露糖蛋白及其他細胞壁成分,通過MyD88髓樣分化蛋白或非MyD88轉(zhuǎn)接蛋白,激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子,從而引起多種細胞因子——如IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α等的表達分泌,促進巨噬細胞的殺菌和吞噬活性。Meier等研究證實,小鼠巨噬細胞識別曲霉孢子依賴TLR2。進一步的體外研究提示,巨噬細胞通過TLR2等識別曲霉孢了,引起促炎因子的產(chǎn)生與釋放,同時募集中性粒細胞至感染部位。 本研究采用煙熏十內(nèi)毒素滴入的方法建立COPD大鼠模型,并通過病理米評價模型。在成功建立COPD大鼠模型的基礎上,我們研究了COPD大鼠肺泡巨噬細胞對曲霉孢子吞噬功能的變化、分泌炎癥因子的特點及可能的調(diào)控機制；從基因水平和蛋白水平研究了COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2的表達情況。 研究方法： 1慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及鑒定 1.1COPD大鼠模型的建立：采用煙熏+內(nèi)毒素滴入的方法,動物每天置于煙室內(nèi)三次,每次45分鐘,COPD組向煙室內(nèi)注入香煙煙霧,對照組注入空氣,共30天(第9、19天除外)。第9、19天試驗組氣道內(nèi)注入濃度為1mg/mL內(nèi)毒素200μL,對照組滴入等量生理鹽水。 1.2COPD大鼠模型的鑒定：第30天將大鼠處死,支氣管肺泡灌洗液(BALF)細胞分類計數(shù)；取下右肺,經(jīng)多聚甲醛固定、病理切片、HE染色,用病理評分的方法對模型進行鑒定。 1.3數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示,服從正態(tài)分布的方差齊性計量資料均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗分析,方差分析不齊時采用Welch近似t檢驗,以a=0.05為統(tǒng)計學差異檢驗水準。 2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞分泌和吞噬功能的變化 2.1COPD大鼠模型的建立同上。 2.2肺泡巨噬細胞的分離培養(yǎng)及鑒定：對大鼠進行肺泡灌洗,將收集的BALF離心后獲得的細胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2孵育2h后去掉未貼壁細胞,并利用CD68單抗對貼壁細胞進行免疫熒光檢測,呈綠色熒光即為肺泡巨噬細胞。 2.3培養(yǎng)上清炎癥因子的測定：同上法分離大鼠肺泡巨噬細胞并培養(yǎng)2h,收集培養(yǎng)上清,采用ELISA測定肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清炎癥因子TNF-α、MIP-2、IL-10及IL-1β的表達。 2.4肺泡巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)的測定：BALF離心后獲得的細胞以1×106/mL接種到六孔板,37℃,5%CO2孵育2h后去上清,加入曲霉孢子混懸液20μL,補足培養(yǎng)體積至1mL,37℃,5%CO2孵育2h,取出蓋玻片行PAS染色,計數(shù)吞噬率及吞噬指數(shù)。吞噬率=(吞噬孢子的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)巨噬細胞總數(shù))×100%；吞噬指數(shù)=吞噬孢子的總數(shù)/吞噬孢子的巨噬細胞數(shù)。 2.5肺泡巨噬細胞NF-κB的表達檢測：提取肺泡巨噬細胞胞漿、胞核蛋白,運用、Vestern blot技術(shù)測定NF-κB的表達。 2.6數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±S表示,服從正態(tài)分布的方差齊性計量資料均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗分析,方差分析不齊時采用Welch近似t檢驗,以α=0.05為統(tǒng)計學差異檢驗水準。 3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞TLR2的表達 3.1COPD大鼠模型的建立同上。 3.2肺泡巨噬細胞的分離培養(yǎng)及處理：將收集的BALF離心后獲得的細胞置于RPMI1640培養(yǎng)液中,37℃,5%CO2孵育2h后去掉未貼壁細胞,然后于各組大鼠肺泡巨噬細胞中分別加入Pam3CYK4(每孔加1ug,濃度1mg/mL)和曲霉孢子(每孔加2.5×106個孢子)及1mL生理鹽水,各自培養(yǎng)4h后收集細胞。 3.3肺泡巨噬細胞TLR2的表達：提取細胞總蛋白,運用qRT-PCR及Westernblot技術(shù),檢測大鼠肺泡巨噬細胞TLR2的表達。 3.4數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差(X+S)表示,主效應與交互效應采用析因分析,單獨效應采用單因素方差分析,以a=0.05為統(tǒng)計學差異檢驗水準。 結(jié)果 1慢性阻塞性肺病大鼠模型的建立 1.1成功建立COPD模型：COPD組肺組織鏡下可見支氣管纖毛柱狀上皮呈鋸齒樣增生增厚,纖毛倒伏,上皮脫落,支氣管腔內(nèi)中性粒細胞及黏液蓄積,管壁結(jié)締組織增生,平滑肌增厚,可見單核細胞和淋巴細胞浸潤,支氣管周圍可見淋巴小結(jié)。肺泡結(jié)構(gòu)紊亂,肺泡壁變薄、斷裂,肺泡腔擴大,部分融合成較大的囊腔。COPD組支氣管炎癥評分顯著高于對照組(4.33+1.16vs.1.33±0.58,P=0.016)。COPD組平均內(nèi)襯間隔(MLI)顯著高于對照組[(168.77+11.35)μmvs.(93.61±4.16)μm,P=0.000)]。BALF細胞分類計數(shù)：COPD組BALF中白細胞總數(shù)較對照組顯著升高[(2.34+0.15)×108/L vs.(1.72±0.30)×108/LP=0.002],分類以肺泡巨噬細胞及中性粒細胞為主[(72.0±±2.2)%和(18.3±±8.3)%]。 2慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞分泌和吞噬功能的變化 2.1細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、MIP-2、IL-10、IL-1p的濃度：COPD組肺泡巨噬細胞培養(yǎng)上清中TNF-α、MIP-2的濃度顯著高于對照組(均為P=0.000),IL-10、IL-1p濃度在兩組間無統(tǒng)計學差異(均為P0.05)。 2.2肺泡巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬率及吞噬指數(shù)：對照組肺泡巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬率顯著高于COPD組(P=0.000)；而對照組與COPD組肺泡巨噬細胞對曲霉孢子的吞噬指數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P=0.053)。 2.3NF-κB p65的表達：COPD組肺泡巨噬細胞胞漿NF-κB p65蛋白的表達水平顯著低于對照組(P=0.011),而胞核的表達水平則顯著高于對照組(P=0.003)。 3慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞TLR2的表達 3.1大鼠肺泡巨噬細胞TLR2基因表達水平 3.1.1經(jīng)析因分析顯示,對照組與COPD組相比,COPD組肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(F=680.60,P=0.000)。三個處理因素相比,曲霉孢子對大鼠肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度影響最大,Pam3CYK4次之,生理鹽水對大鼠肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度影響最小,差異具有統(tǒng)計學意義(F=353.21,P=0.000)。煙霧和生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效應(F=17.79,P=0.000),即COPD組分別滴加生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4后,肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度的差異比對照組大；可認為煙霧可影響經(jīng)生理鹽水、曲霉孢了或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬細胞TLR2基因的表達水平。 3.1.2基礎狀態(tài)下,COPD組肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后,COPD組肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度均低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000) 3.1.3滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度均高于基礎狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的對照組肺泡巨噬細胞TLR2基因轉(zhuǎn)錄強度也均高于基礎狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。 3.2大鼠肺泡巨噬細胞TLR2蛋白表達水平 3.2.1經(jīng)析因分析顯示,對照組與COPD組相比,COPD組肺泡巨噬細胞TLR2蛋白表達水平高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(F=349.58,P=0.000)。三個處理因素相比,曲霉孢子對大鼠肺泡巨噬細胞TLR2蛋白表達水平影響最大,Pam3CYK4次之,生理鹽水對大鼠肺泡巨噬細胞TLR2蛋白表達水平影響最小,差異具有統(tǒng)計學意義(F=77.08,P=0.000)。煙霧和生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4存在交互效應(F=18.07,P=0.000),即COPD組分別滴加生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4后,肺泡巨噬細胞TLR2蛋白表達水平的差異比對照組大；可認為煙霧可影響經(jīng)生理鹽水、曲霉孢子或Pam3CYK4刺激的大鼠肺泡巨噬細胞TLR2蛋白的表達水平。 3.2.2基礎狀態(tài)下,COPD組肺泡巨噬細胞TLR2蛋白的表達水平低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4后,COPD組肺泡巨噬細胞TLR2蛋白的表達水平均低于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。 3.2.3滴加曲霉孢了或Pam3CYK4的COPD大鼠肺泡巨噬細胞TLR2蛋白的表達水平均高于基礎狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)；滴加曲霉孢子或Pam3CYK4的對照組肺泡巨噬細胞TLR2蛋白的表達水平也均高于基礎狀態(tài),差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.000)結(jié)論 本實驗采用煙熏+內(nèi)毒素氣道滴注的方法成功建立了COPD大鼠模型,其表現(xiàn)為以中性粒細胞、巨噬細胞為主的慢性炎癥；肺泡巨噬細胞NF-κB p65活化,TNF-α、MIP-2等促炎因子表達水平增加,吞噬功能減退,此可能與長期的煙霧暴露導致的肺泡巨噬細胞TLR2不能正常上調(diào)相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：慢性阻塞性肺疾病 肺泡巨噬細胞 Toll樣受體2 核因子-κB 炎癥
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R563.9
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-19
• 前言19-21
• 第一章 慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立21-30
• 1 實驗動物、儀器與試劑21-23
• 2 實驗方法23-25
• 3 結(jié)果25-27
• 4 討論27-30
• 第二章 慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞分泌和吞噬功能的變化30-47
• 1 實驗動物、儀器與試劑30-33
• 2 實驗方法33-41
• 3 結(jié)果41-45
• 4 討論45-47
• 第三章 慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞TLR2的表達47-63
• 1 實驗動物、儀器與試劑47-49
• 2 實驗方法49-55
• 3 結(jié)果55-60
• 4 討論60-63
• 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-67
• 中英文縮寫對照表67-68
• 成果68-69
• 致謝69-71
• 統(tǒng)計學審稿證明71

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 樓標雷;修清玉;;慢性阻塞性肺疾病中的氧化應激[J];東南國防醫(yī)藥;2007年03期

2 顧有方,陳會良,劉德義,商常發(fā);自由基的生理和病理作用[J];動物醫(yī)學進展;2005年01期

3 吳丹;李芳秋;;巨噬細胞在煙曲霉感染中的作用[J];醫(yī)學研究生學報;2009年11期

4 張永,程德云,王慧,蘇巧俐,陳小菊,關(guān)鍵;慢性阻塞性肺疾病大鼠肺內(nèi)白細胞介素-8和腫瘤壞死因子-α與氣道炎癥的關(guān)系研究[J];中國呼吸與危重監(jiān)護雜志;2003年06期

  本文關(guān)鍵詞：慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡巨噬細胞吞噬功能減退及其機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：310341