肺纖維化是間質性肺疾病的最終結局,目前尚無控制或逆轉病情的有效治療方法,肺移植是唯一可以延長肺纖維化患者生存期的方法,因其代價昂貴和供體稀缺,所以不能普遍開展。在現(xiàn)代分子生物學和基因工程技術飛速發(fā)展的推動下,基因治療肺纖維化有望成為一種突破性的治療手段。 肺纖維化被認為是局限于肺部的一種成纖維細胞增殖性疾病,上皮細胞受損直接導致肺纖維化形成,伴或不伴間質炎癥,屬于上皮-成纖維細胞疾病。依據(jù)這個觀點,上皮細胞受損后發(fā)生上皮—間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)轉變?yōu)槌衫w維細胞和成纖維細胞增殖是肺纖維化形成的兩個主要環(huán)節(jié),那么,抑制上皮細胞EMT和后續(xù)增殖是治療肺纖維化的兩個有效靶點。 Napsin A是天門冬氨酸蛋白酶家族中的成員之一,在Ⅱ型肺泡上皮細胞中有明顯表達。研究發(fā)現(xiàn)它除了具有蛋白水解酶活性外,還有調節(jié)細胞多種生物學行為的功能。國內外學者研究發(fā)現(xiàn)細胞在表型發(fā)生轉化后,比如惡性轉化,Napsin A表達下調,且下調幅度與表型轉化程度成正相關,提示Napsin A的缺失可能是細胞表型轉化的原因之一,恢復Napsin A的表達或許可以逆轉這一過程。也有研究將Napsin A基因導入細胞DNA中發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力在體內外實驗中均受到抑制,Napsin A可以抑制細胞的增殖能力。本課題利用Napsin A抑制細胞表型轉化和增殖能力的生物學功能研究其抗肺纖維化作用的價值。 本研究的目的在于： 將Napsin A基因轉染至Ⅱ型肺泡上皮細胞系——A549細胞,并構建體外肺纖維化模型,研究Napsin A基因對體外肺纖維化模型的干預作用同時探討相關機制。 研究方法如下： 1.體外培養(yǎng)A549細胞,予TGF-β1刺激構建體外肺纖維化模型,TGF-β1設置5個濃度梯度,MTT法篩選出最佳濃度,倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的動態(tài)變化確定建模時間。模型構建后用RT-PCR和Western-blot方法檢測到細胞上皮標志蛋白和間質標志蛋白的表達以鑒定模型。 2.構建重組慢病毒質粒PLJM1-Napsin A,以Lipofectamine2000TM將PLJM1-Napsin A轉染給包裝細胞293T細胞,收集病毒懸液感染A549細胞,用抗生素嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定的A549-PLJM1-Napsin A細胞株,并對細胞表達目的基因和目的蛋白進行鑒定。 3.構建體外肺纖維化模型,MTT法及流式細胞術檢測Napsin A對A549細胞在EMT過程中增殖能力的影響,模型構建后用RT-PCR和Western-blot方法檢測細胞上皮標志蛋白和間質標志蛋白的表達以研究Napsin A對A549細胞EMT的干預作用。 4.構建裸鼠A549細胞腫瘤模型,繪制瘤體生長曲線及計算抑瘤率,瘤體HE染色病理切片觀察A549細胞生長情況,體內研究NapsinA對A549細胞增殖能力的影響。 5.Western-blot方法檢測A549細胞中整合素信號傳導通路的基礎分子—黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的表達,探討NapsinA干預A549細胞增殖和EMT的作用機制。 研究結果如下： 1.構建體外肺纖維化模型,MTT法檢測發(fā)現(xiàn)A549細胞在濃度為5μg/L TGF-β1誘導時生長速率最大,篩選出TGF-β1最佳濃度為5μg/L;倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)在TGF-β1誘導后第7天完全演變?yōu)殚g質細胞形態(tài),確定第7天為模型完成時間；模型構建完成后,RT-PCR和Western-blot方法檢測到細胞表達E鈣蛋白明顯下調,而纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原表達則顯著上調。 2.構建重組慢病毒質粒PLJM1-Napsin A,選取5個單克隆行PCR鑒定,均能擴增出Napsin A mRNA條帶,大小約為1.2 kb,質粒PLJM1-Napsin A經自動基因測序儀測序,結果與設計序列完全符合,所含目的基因序列準確無誤。RT-PCR和Western-blot方法檢測A549-PLJM1-Napsin A細胞株表達Napsin A基因和蛋白均明顯增加。 3.體外肺纖維化模型中,MTT法檢測A549-PLJM1-Napsin A細胞在EMT過程中增殖能力受到抑制,流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)其細胞周期被阻滯在G0/G1期；A549-PLJM1-Napsin A細胞在模型中其細胞形態(tài)間質變、E鈣蛋白表達下調趨勢、纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原表達上調幅度均受到部分抑制,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 4.裸鼠A549細胞腫瘤模型成功構建,A549-PLJM1-Napsi A細胞瘤體生長相對緩慢,抑瘤率達39.8%,瘤體HE染色病理切片觀察A549-PLJM1-Napsin A細胞胞體變圓,相對稀疏,核染色質凝集深染。 5.Western-blot方法檢測到A549細胞在體外肺纖維化模型中表達FAK顯著增加,但轉染Napsin A基因后表達FAK增加趨勢變小 由此得出以下結論： 1.TGF-β1誘導A549細胞增殖和EMT,成功構建了體外肺纖維化模型。 2.利用慢病毒載體成功構建了A549-PLJM1-Napsin A細胞株,并且穩(wěn)定持久表達Napsin A mRNA和蛋白。 3.體內外試驗結果提示Napsin A對細胞增殖有抑制作用。 4.體外肺纖維化模型實驗中,Napsin A可以部分抑制細胞EMT。 5.Napsin A對細胞增殖和EMT的抑制作用與下調FAK表達、抑制整合素信號傳導通路有關。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2011
【中圖分類】：R563.9
【部分圖文】：

圖1.1肺泡及肺泡壁模式圖Figure1.1Alveoliandalveolarwalldiagram3肺纖維化病理各型肺纖維化雖然起因不同，但纖維化的發(fā)展與結局基本相似，即由下癥細胞浸潤起始，逐步引起肺泡上皮細胞和血管內皮細胞損傷，并伴有促泡上皮細胞和肌成纖維細胞增殖的細胞因子釋放，形成成纖維細胞灶，導基質蛋白和膠原沉積，最終引起肺纖維化。早期或急性期可見肺泡壁和間質內淋巴細胞、漿細胞、單核細胞、組粒細胞及酸性粒細胞浸潤，此時肺泡腔可以不累及，但也可以有細胞落的肺泡上皮細胞、巨噬細胞等)和纖維蛋白滲出，肺泡間隔內網硬蛋尚未發(fā)生纖維化。隨著疾病進展，炎癥細胞滲出和浸潤減少;I型肺泡上皮細胞變性，

江蘇大學博士學位論文:NaPsinA基因治療肺纖維化的體外實驗研究及作用機釗探討病的I幾皮一lbJ質轉化(epithelial一mesenchymaltra，lsition，EMT)學說(圖1.2)。兒等‘’2)研究證實，在實驗性肺纖維化模型中，上皮細胞是間質細胞的主要末源。willisBc等‘’3)研究發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞發(fā)生上皮一間質轉化后轉變成兼具膠原分與收縮功能的間質細胞，大大加快了肺纖維化進程。

法，包括:逆轉錄病毒載體、腺病毒及相病毒載體、疤疹病毒載體等，其中腺病毒外酶基因轉移，是目前研究較多的兩種載irus)載體屬于逆轉錄病毒載體，是基于人6cien即virustypex，Hxv一i)為基礎發(fā)展起來較其他傳統(tǒng)病毒載體系統(tǒng)而一言具有諸多優(yōu)，因此慢病毒及其載體的研究近年來成為的一般生物學特性逆轉錄病毒之一，為RNA病毒。慢病毒在身反轉錄酶的作用下合成cDNA，再以此c過病毒整合酶作用整合到宿主細胞的染色
【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

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本文編號：2869233