目的塵肺是我國目前最常見的危害較為嚴重的一種職業(yè)性肺部疾病,專家估計塵肺病實際發(fā)生的病例數不少于100萬人,預計今后10年至15年我國塵肺病發(fā)病總數還將呈繼續(xù)上升趨勢。根據2005年塵肺病例數據分析表明,矽肺和煤工塵肺仍是最主要的塵肺病,兩者共占塵肺病例總數的90.8%,其中矽肺病例占塵肺總病例約50%,是塵肺中危害最嚴重的職業(yè)病之一。目前比較公認的矽肺發(fā)病機制有矽塵毒性、脂質過氧化作用、肺內細胞機制、細胞因子網絡等,但是尚未最終闡明,從而嚴重制約了矽肺病的臨床早期診斷與治療的發(fā)展。支氣管肺泡灌洗術(BAL)用于肺部疾病的研究,已有近百年的歷史。近30年來,由于纖維支氣管鏡的發(fā)明與引入,使BAL作為一種相對安全的技術手段,更被廣泛用于科研和臨床。支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的成分來源于氣道及肺泡上皮表層,它能反映肺實質的病變過程。對其中有形成分和無形成分進行分析,探索哪些物質的改變在塵肺早期病變中起到了關鍵性作用,試圖尋找矽肺早期診斷和肺纖維化進程評價的生物標志,為進一步揭示塵肺的發(fā)病機制提供參考。 方法選用SPF級健康成年雄性SD大鼠40只體重(200±16)g,隨機分成對照組和實驗組;分別以0.9%的生理鹽水lml、50mg/ml的SiO2混懸液lml氣管內灌注,制備正常及染矽塵動物模型;兩組大鼠40天后經股動脈放血處死,通過支氣管肺泡灌洗術獲取兩組大鼠的BALF樣品;對BALF中的細胞成分進行總數計數及分類計數;分別采用Bradford法、黃嘌呤氧物酶法、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)、ELISA法對BALF中的總蛋白含量、SOD活力、微量元素(鐵、鋅、錳)、CC10的含量進行測定;采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術初步分離BALF中可溶性蛋白成分;利用蛋白質組學的雙向電泳技術,按200μg蛋白加樣量將蛋白樣品溶液與水化緩沖液混勻,總體積為340μl(IPG膠條18cm,pH3～10),進行第一相等電聚焦,再以10%SDS-PAGE作第二相分離,分別對兩組BALF中的蛋白質成分進行分離;同時對肺組織進行HE染色,普通光鏡下觀察肺組織的病理學改變。 結果 1染矽塵組大鼠BALF中細胞總數為(1.21±0.44)×107/ L、白細胞總數為(1.14±0.51)×106/ L、中性粒細胞總數為(0.53±0.08)×106/ L、巨噬細胞總數為(9.97±3.91)×106/ L、淋巴細胞總數為(0.94±0.42)×106/ L,正常組大鼠BALF中細胞總數為(6.30±2.19)×106/ L、白細胞總數為(0.52±0.21)×106/ L、中性粒細胞總數為(0.21±0.09)×106/ L、巨噬細胞總數為(5.04±1.52)×106/ L、淋巴細胞總數為(0.31±0.15)×106/ L。結果顯示染矽塵組大鼠較正常組大鼠BALF中細胞總數及各類炎性細胞數均明顯升高(P 0.05); 2染矽塵組大鼠BALF中總蛋白含量為1.06±0.56g/l、上清中SOD活力為14.24±8.01U/ml、細胞中SOD活力為22.01±6.46 U/mgprot,正常組大鼠BALF中總蛋白含量為0.62±0.27 g/l、上清中SOD活力為13.61±8.61U/ml、細胞中SOD活力為14.01±7.38 U/mgprot。結果顯示染矽塵組大鼠BALF中總蛋白含量及細胞中SOD活力較正常組大鼠均明顯升高(P 0.05),而兩組大鼠上清中SOD活力差別無統(tǒng)計學意義(P 0.05); 3染矽塵組大鼠BALF中鐵、鋅、錳元素含量分別為1.84±1.10μg/ml、6.03±2.54μg/ml、0.16±0.05μg/ml,正常組BALF中鐵、鋅、錳元素含量分別為4.76±1.70μg/ml、2.51±1.77μg/ml、0.09±0.04μg/ml。其中染矽塵組大鼠BALF中鋅、錳元素的含量較正常組明顯升高,而鐵元素的含量則較正常組降低(P 0.05); 4染矽塵組大鼠BALF中CC10的含量(0.77±0.22g/l)較正常組大鼠降低(0.41±0.15g/l)(P 0.05); 5采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術獲得了兩組BALF較清晰的蛋白質條帶,兩組大鼠BALF中所分離出的蛋白質條帶相比較發(fā)現無論是條帶的數量還是條帶的深淺程度均發(fā)生變化; 6采用雙向電泳技術分離蛋白質,獲得了較清晰的正常及染矽塵大鼠BALF中蛋白質的雙向電泳圖譜。兩組大鼠BALF的2-DE圖譜進行比較,發(fā)現兩組BALF中蛋白成分存在明顯的差異,這些差異主要表現在電泳圖譜中蛋白斑點的增減以及染色的深淺上。 7常規(guī)病理切片顯示正常組大鼠肺組織結構完整,肺泡壁均勻、清晰;染矽塵組大鼠可見肺組織結構出現不同程度的破壞,并出現典型的矽結節(jié)的改變,矽結節(jié)以細胞成分為主,其內膠原纖維增加;肺間質纖維組織增生;肺組織出現嚴重的病理學改變。 結論 1本實驗發(fā)現大鼠染矽塵后BALF中的細胞成分包括白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞從數量上出現明顯的升高(P0.05),炎癥細胞數量的增加,提示矽塵進入肺組織后誘導出現了嚴重的炎癥反應,造成了肺組織的損傷。 2本實驗通過對正常及染矽塵大鼠BALF中的蛋白含量、SOD活力、微量元素(鐵、鋅、錳)含量的測定發(fā)現在肺組織出現損傷及其損傷修復的過程中這些物質都發(fā)生了明顯的變化(P 0.05),通過對其作用機制的分析,可以為最終闡明塵肺的發(fā)病機制起到一定的參考作用。 3本實驗發(fā)現大鼠染矽塵后BALF中的CC10表達減少(P 0.05),檢測CC10可反映早期Clara細胞的損傷情況,從而獲悉一些肺組織病變發(fā)生及發(fā)展變化的情況,BALF中CC10含量的變化可以作為肺損傷出現及其恢復的標志物之一。 4通過運用蛋白質組研究的雙向電泳技術,對兩組動物BALF中的可溶性蛋白成分進行了分離,獲得了清晰的正常及矽肺大鼠BALF中蛋白質的雙向電泳圖譜,兩組大鼠BALF2-DE圖譜的差異揭示了相對于正常組,染矽塵組BALF中蛋白成分產生了質和量的改變。
【學位單位】：華北煤炭醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2009
【中圖分類】：R135.2
【文章目錄】：
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結果
討論
結論
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綜述 染塵大鼠支氣管肺泡灌洗液成分分析
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本文編號：2859682