研究背景 嚴(yán)重急性呼吸綜合征(Severe acute respiratory syndrome，mARS)是一種以呼吸道癥狀為主的急性傳染病，其主要病變以急性肺損傷(acute lunginjury，ALI)為主，可合并全身多臟器損害，病死率較高，引起國際社會廣泛關(guān)注和醫(yī)學(xué)界的高度重視。在各國醫(yī)學(xué)專家的共同努力下，2003年4月16日世界衛(wèi)生組織(WHO)正式宣布，mARS是由一種新型冠狀病毒引起，并命名為SARm冠狀病毒(SARm coronavirus，SARS-CoV)。根據(jù)WHO統(tǒng)計，2002～2003年SARS流行期間，全球共有8400名確診病例，約900余名患者死亡，由于該病傳染性強，發(fā)病率及死亡率高，被譽為21世紀(jì)初世界范圍內(nèi)發(fā)生的重大事件之一。 廣東省曾是我國SARS發(fā)病最早，發(fā)病率最高，影響最大的省份，為弄清SARS病因及發(fā)病機制，我們在當(dāng)時對本病認識不清，無特殊防護條件下，開展了國際首例和較早的3例尸檢，雖然目前在病原學(xué)及流行病學(xué)等方面取得重大進展，但其發(fā)病機制尚不完全清楚，因此我們利用4例尸檢資料，對mARS-CoV在全身組織和器官的分布及發(fā)病機制進行探討，希望對mARS及其它呼吸道病毒疾病的預(yù)防和治療提供有用信息。 目的 1．對病變組織內(nèi)病毒包涵體、病毒顆粒以及SARS-CoV N基因及S基因進行原位檢測，觀察SARS-CoV在全身組織和器官的分布、探討SARS-CoV傳播途徑及致病機制； 2．通過觀察SARS尸檢組織中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(angiotensin-convertingenzyme 2，ACE2)與SARS-CoV S蛋白的分布，探討ACE2和SARS-CoY S蛋白在SARS尸檢組織中的表達及其相互作用關(guān)系； 3．通過檢測免疫細胞標(biāo)志物及細胞因子(CD3、CD4、CD8、CDl6、CD20、CD25、CD45RO、CD68、Ki67、Mac387、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1)在SARS病變組織中的表達，分析它們在SARS發(fā)病中的作用； 4．通過檢測SARS病變組織的細胞凋亡情況，闡述細胞凋亡在SARS發(fā)病中的作用機制。 材料和方法 收集2003年3月至5月期間第一軍醫(yī)大學(xué)南方醫(yī)院病理科4例SARS完整尸體解剖資料，分別取肺、氣管、心臟、肝、腎、腎上腺、脾、食道、胃、小腸、胰腺、腦、垂體、甲狀腺、甲狀旁腺、淋巴結(jié)、皮膚、子宮、卵巢以及睪丸等組織，4例尸檢病例均符合WHO SARS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，以心源性猝死患者相應(yīng)組織作為對照。全部標(biāo)本用4％中性甲醛固定，石蠟包埋，4μm切片。 采用組織病理學(xué)、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)雙染法、免疫組織化學(xué)與組織化學(xué)雙染法、原位雜交技術(shù)及透射電鏡等方法對4例SARS尸檢組織中病毒包涵體、病毒顆粒、SARS-CoV N基因、SARS-CoV S基因、免疫細胞標(biāo)志物(CD3、CD4、CD8、CDl6、CD20、CD25、CD45RO、CD68、Ki67、Mac387)、細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β1、MCP-1)、功能性受體ACE2以及凋亡細胞(Klenow-FragEL DNA Fragmentation、Fas／FasL)進行檢測。 結(jié)果 1．肺組織病原體原位檢測結(jié)果： 1．1組織病理學(xué)觀察：4例尸檢肺組織部分增生脫落的肺泡上皮細胞及滲出的單核巨噬細胞內(nèi)可見病毒包涵體，包涵體多呈球形，約紅細胞大小，嗜酸性染色，周圍可見透明暈。 1．2組織化學(xué)觀察：對4例SARS肺組織用Macciavello法(病毒包涵體染色)進行檢測，3例肺組織肺泡上皮及局部浸潤單核細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)典型的病毒包涵體，包涵體紅細胞大小呈紫紅色。 1．3透射電鏡觀察：肺泡上皮明顯腫脹，內(nèi)漿網(wǎng)擴張，線粒體及內(nèi)漿網(wǎng)明顯空泡變性。Ⅰ型和Ⅱ型上皮細胞增生，尤以Ⅱ型上皮增生明顯。增生的Ⅱ上皮細胞胞漿板層小體明顯減少或缺如，粗面內(nèi)漿網(wǎng)(PER)及滑面內(nèi)漿網(wǎng)(SER)均大量增生、擴張，擴張SER池內(nèi)有電子密度增高的蛋白分泌物，部分擴張的SER內(nèi)可見群集的、大小較一致的病毒顆粒，表面有細小的花冠狀微粒，顆粒大小約60-90nm。部分胞核內(nèi)見有膜性層狀包涵體。間質(zhì)血管內(nèi)皮細胞腫脹、空泡變性。肺泡腔內(nèi)有少量滲出的單核細胞、淋巴細胞和漿細胞。 1．4免疫組化觀察：SARS-CoV N蛋白及S蛋白特異性單克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞、單核巨噬細胞、支氣管纖毛柱狀上皮細胞及漿液腺腺上皮細胞均呈陽性表達，正常對照肺組織SARS-CoV N蛋白及S蛋白標(biāo)記陰性。 1．5原位分子雜交觀察：SARS-CoV N及S基因mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細胞、單核巨噬細胞、支氣管纖毛柱狀上皮細胞及漿液腺腺上皮細胞均可見陽性雜交信號；正常對照肺組織SARS-CoV N及S基因mRNA雜交信號陰性。 2．肺外組織病原體原位檢測結(jié)果： 對4例SARS尸檢組織N基因及S基因從蛋白和mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)食道鱗狀上皮、胃壁細胞、小腸黏膜柱狀上皮細胞、心肌纖維、腎遠曲小管上皮細胞、皮膚汗腺上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、甲狀旁腺嗜酸性細胞、胰腺胰島細胞、大腦神經(jīng)元、垂體嗜酸性細胞、肝細胞及睪丸曲細精管等均呈陽性表達；而在SARS脾及淋巴結(jié)淋巴細胞、甲狀腺、卵巢、子宮等細胞或組織未檢測到SARS-CoV N基因及S基因；對照組SARS-CoV N基因及S基因蛋白和mRNA均呈陰性。 3．功能性受體ACE2基因與SARS-CoV S基因檢測結(jié)果比較 對4例SARS尸檢組織ACE2及S基因從蛋白和mRNA水平檢測支氣管、肺、心肌、肝、腎、腎上腺、胃、小腸、胰腺、腦、甲狀腺、甲狀旁腺、皮膚、睪丸、卵巢及子宮等組織發(fā)現(xiàn)肺組織增生和脫落的上皮細胞及浸潤的單核／巨噬細胞、氣管及支氣管上皮細胞及漿液腺腺上皮細胞、小腸黏膜柱狀上皮細胞、心肌纖維、胃壁細胞、腎遠曲小管上皮細胞、食道粘膜鱗狀上皮、皮膚汗腺上皮細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、甲狀旁腺嗜酸性細胞、胰腺胰島細胞、大腦神經(jīng)元、垂體嗜酸性細胞、肝細胞及睪丸曲細精管等蛋白和mRNA檢測均呈陽性；脾臟及淋巴結(jié)淋巴細胞、甲狀腺、卵巢及子宮無陽性表達。蛋白表達陽性部位定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色；雜交信號定位于細胞質(zhì)，呈藍黑色；對照組相應(yīng)組織ACE2基因蛋白和mRNA水平檢測與SARS尸檢組織檢測結(jié)果一致，SARS-CoV S基因蛋白和mRNA水平檢測均呈陰性。 4．病理變化觀察及免疫細胞標(biāo)志物檢測結(jié)果 肺：病變肺組織呈脫屑性肺泡炎及脫屑性支氣管炎改變，肺泡腔內(nèi)充滿大量脫落和增生的肺泡上皮細胞，增生脫落的肺泡上皮細胞體積明顯增大，部分細胞相互融合呈合體細胞狀，肺泡腔內(nèi)可見透明膜形成，肺組織局灶性壞死，壞死處可見中性粒細胞、單核巨噬細胞及少量淋巴細胞浸潤；淋巴結(jié)：淋巴濾泡消失，淋巴細胞呈點片狀壞死，淋巴竇內(nèi)可見大量單核巨噬細胞增生，部分單核巨噬細胞呈活化狀態(tài)，經(jīng)Ki67及CD45RO雙染標(biāo)記的T淋巴細胞呈散在陽性，CD4~+、CD8~+T．淋巴細胞，自然殺傷細胞(NK細胞)明顯減少；脾：脾小體高度萎縮，紅髓淋巴組織大片狀壞死，壞死灶內(nèi)可見成片的單核巨噬細胞浸潤；心臟：心肌間質(zhì)水腫，間質(zhì)內(nèi)小血管內(nèi)皮細胞腫脹，血管壁水腫，可見單核和淋巴細胞浸潤；肝臟：肝細胞索明顯解離，肝細胞脂肪變性及小灶性壞死，可見單核巨噬細胞浸潤；腎臟及腎上腺組織可見小灶性壞死，腎間質(zhì)小動脈、小靜脈呈血管炎的表現(xiàn)，局部主要浸潤細胞為單核和淋巴細胞。 5．細胞因子檢測結(jié)果 對4例SARS尸檢組織肺、支氣管、食管、胃、小腸、肝、心肌、血管、腎、腎上腺、胰腺、腦組織、甲狀腺、甲狀旁腺、睪丸及皮膚等組織細胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1蛋白和mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)肺組織增生和脫落的上皮細胞及浸潤的單核／巨噬細胞、氣管及支氣管上皮細胞及漿液腺腺上皮細胞、胃壁細胞、肝細胞、心肌纖維、腎遠曲小管上皮細胞、胰腺胰島細胞、腎上腺皮質(zhì)細胞、皮膚汗腺上皮細胞、腦垂體嗜酸性細胞均呈不同程度陽性表達，小腸黏膜柱狀上皮細胞MCP-1和TGF-β1標(biāo)記顯示陽性、食管鱗狀上皮、甲狀旁腺、睪丸生精上皮及甲狀腺濾泡上皮細胞呈陰性表達。正常對照組腎遠曲小管上皮細胞TGF-β1及TNF-α呈陽性表達，余陰性。陽性部位定位于細胞質(zhì)，呈棕黃色。用免疫組織化學(xué)與奧新蘭雙重染色發(fā)現(xiàn)支氣管漿液腺腺上皮細胞IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1呈棕黃色，而黏液腺上皮細胞顯示藍色。 6．細胞凋亡檢測結(jié)果 經(jīng)Klenow-FragEL DNA Fragmentation、Fas／FasL檢測發(fā)現(xiàn)肺組織、脾臟和淋巴結(jié)的凋亡細胞明顯增多。病變肺組織的凋亡細胞主要為肺泡上皮細胞、支氣管上皮細胞、單核巨噬細胞等；病變淋巴結(jié)和脾臟內(nèi)可見大量淋巴細胞和單核巨噬細胞存在凋亡現(xiàn)象。 結(jié)論 1．SARS是一種全身多器官損傷性疾病，肺是SARS病毒主要攻擊的靶器官，急性肺損傷是本病死亡的主要原因； 2．首次提出SARS除呼吸道和消化道傳播外，還可能通過尿液和皮膚接觸傳播的新觀點； 3．功能性受體ACE2與SARS-CoV S基因在多種細胞內(nèi)表達和定位一致，首次在SARS尸檢組織中確認ACE2為SARS-CoV的功能性受體； 4．前炎癥細胞因子(IL-1β，IL-6，TNF-α，TGF-β1，MCP-1)與SARS-CoV S蛋白及受體ACE2在組織和細胞內(nèi)表達一致，提示SARS-CoV感染的細胞可能過度分泌PlCs(proinflammatory cytokines，Pies)，引起免疫介導(dǎo)的肺和其它器官損害，導(dǎo)致ALI和全身多器官機能障礙； 5．細胞凋亡可能在ALI發(fā)生中起重要作用。
【學(xué)位單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2006
【中圖分類】：R511.9
【部分圖文】：

4擴張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)充滿下

圖卜7支氣管漿液腺州蛋白，IHC)SARS一 CoVNproteinexPression圖1一8皮膚汗腺(N蛋白，IHC) inbronehialserousglandePithelium(Figurel一7)and sweatglandcells(Figurel一 8)byIHC、氣、心、謬每俗如擎?zhèn)湫揖春簋A，·公、‘O、藕*一藝。尹圖1一9腎遠曲小管上皮細胞困蛋白，IHC)圖1一10腦垂體嗜酸性細胞困蛋白，IHC)SARS一 CoVNProteinexPreacidoPhilie ssionindistaleonvolutedrenaltubules(Figure]一9)and eellsofPituitary(Figurel一 10)byIHC

診份i嘿鉀孤圖卜5肺泡上皮細胞(N蛋白，IHC)圖1一單核巨噬細胞伽蛋白，IHC)Figurel一5， 6SARS一 CoVNproteinexpressioninpneumocytesandmonocytes·侮謬_男t、斗.鷺黔、恤、，，擴.籌‘泰瀟沙蛇夸產(chǎn)竺二今佗鏟、戶襲翻一匆兮戶加，稱，每翻圣.‘滬:礦矛丈J蒸扮…、尹曝粼群‘’、.丫冬，廠今‘戚…羨孑淤廠汾戶毅如沖夢腸泊圖卜7支氣管漿液腺州蛋白，IHC)SARS一 CoVNproteinexPression圖1一8皮膚汗腺(N蛋白

【參考文獻】

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本文編號：2829393