【摘要】： 背景：特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是指原因不明并以普通型間質性肺炎(usual interstitial pneumonia，UIP)為病理特征的一種慢性炎癥性肺疾病，病情進行性發(fā)展，最終多因呼吸衰竭導致死亡，探討肺纖維化發(fā)生機制，將為其臨床治療提供新思路。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是內皮細胞強烈而特異有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性因子，是主要血管生成調節(jié)因子，它與其受體結合發(fā)揮作用。VEGF主要生物學效應是促進血管內皮細胞存活、增殖、分化、遷移和促進新生血管形成。此外，VEGF還可誘導整合素表達，參與炎細胞移動、維持其存活和促進TGF-β1表達等，在肺纖維化形成早期過表達。但目前研究主要集中在抗腫瘤新生血管形成，其致炎作用，特別是在纖維化中作用研究較少。采用VEGF受體阻斷劑SU5416阻斷VEGF受體信號轉導干預肺纖維化，有助于探討VEGF／VEGFR信號途徑在肺纖維化中的作用及其機制。 目的：通過檢測VEGF及其受體在肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中表達，了解它們在肺纖維化中的變化特點；利用SU5416在肺纖維化不同時間對VEGF信號干預，了解其抗纖維化作用；經TGF-β1、LDH檢測和炎性細胞分類計數等，初探SU5416的抗纖維化機制。 方法：小鼠氣管內注入博來霉素建立肺纖維化(bleomycin-inducedpulmonary fibrosis，BPF)模型。肺組織，采用HE染色、Ashcroft評分評估纖維化程度；免疫組化法檢測VEGF、Flk-1和CD31(新生血管形成)表達；熒光定量RT-PCR分析VEGF、Flk-1 mRNA表達；western-blot法分析p-Smad3。支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，速率法檢測LDH活力和白細胞計數、分類計數；用酶聯(lián)免疫吸附(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)法測定TGF-β1、VEGF含量。 結果 一、HE染色和Ashcroft評分： 鏡下見氣管內注入博來霉素早期肺組織損傷以胸膜下區(qū)明顯，肺泡間隔輕度增寬、病灶區(qū)域巨噬細胞等炎性細胞浸潤明顯、膠原纖維沉積少；晚期損傷分布較廣，肺組織纖維沉積明顯、炎性細胞浸潤少。對照組無明顯組織炎性浸潤和間質纖維沉積。 對照組第7、14和28天Ashcroft評分分別為0.325±0.016、0.333±0.017和0.340±0.019；模型組第7天肺組織Ashcroft評分明顯升高，第14和28天仍逐漸增加，與對照組比較有顯著差異(P0.01)。肺纖維化SU5416早期處理組Ashcroft評分與對照組相應時間點比較存在差異(P0.05)，與模型組、溶媒干預組和SU5416晚期處理組比較亦顯著差異(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組與模型組比較無顯著差異(P0.05)。 二、熒光定量RT-PCR與免疫組化： 小鼠肺組織VEGF和VEGFR-2 mRNA、蛋白表達，與對照組比較，模型組第7天VEGF、VEGFR-2明顯過表達，第14和28天逐漸下降(P0.01)。SU5416早期干預后，第7和14天VEGF和VEGFR-2 mRNA無過表達，第28天亦有降低(P0.05)；與對照組比較無明顯差異(P0.05)；與模型組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組與模型組比較無顯著差異(P0.05)。 三、ELISA檢測結果： 小鼠BALF中VEGF和TGF-β1變化，與對照組比較，模型組第7天VEGF和TGF-β1明顯過表達，第14和28天逐漸下降(P0.01)。SU5416早期干預后，第7和14天VEGF和TGF-β1無過表達，第28天亦有降低(P0.05)；與對照組比較無明顯差異(P0.05)；與模型組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組與模型組比較無顯著差異(P0.05)。 四、masson染色： 與對照組比較，模型組第7天masson蘭染膠原IOD值明顯升高，第14和28天逐漸增加(P0.01)。SU5416早期處理后，第7天蘭染膠原IOD值無增加；第14和28天稍增加，蘭染IOD值與相應時間點對照組比較有明顯差異(P0.05)；與模型組、溶媒和SU5416晚期處理組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組與模型組比較無顯著差異(P0.05)。 五、分光光度法(spectrophotometry)檢測肺組織羥脯氨酸含量： 與對照組比較，模型組肺組織羥脯氨酸含量變化第7天羥脯氨酸含量明顯升高，第14和28天逐漸增加。SU5416早期處理后，第7天羥脯氨酸含量無增加；第14和28天稍增加，羥脯氨酸含量與對照組比較有明顯差異(P0.05)；與模型組比較有顯著差異(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組與模型組比較無顯著差異(P0.05)。 六、新生血管形成： 與對照組比較，模型組肺組織新生血管形成第7天新生血管形成明顯增多，第14和28天逐漸下降(P0.01)。SU5416早期干預后，第7和14天新生血管形成無過多現(xiàn)象，第28天稍低(P0.05)；與對照組比較無明顯差異(P0.05)；與模型組間有顯著差異(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組與模型組比較無顯著差異(P0.05)。 七、western-blot檢測p-Smad3表達： SU5416早期處理組p-Smad3表達低于溶媒處理組和晚期SU5416處理組(P0.01)。溶媒干預組、晚期SU5416處理組間比較無顯著差異(P0.05)。 八、速率法檢測BALF中LDH活力： 第7、14和28天SU5416早期處理組BALF中LDH／P值分別為320.9±15.4和102.4±7.4、106.1±4.7U／mg，(P0.05)；與模型型組比較顯著降低(P0.01)；與對照組比較稍高(P0.05)。模型組和溶媒干預組間無明顯差異(P0.05)。 九、BALF中白細胞計數和分類計數： 造模后第7天，模型組、溶媒組和SU5416晚期處理組BALF中白細胞總數較對照組明顯增高，細胞分類計數以巨噬細胞增高明顯(P0.01)；SU5416早期處理組BALF中巨噬細胞、中性粒細胞數較模型組顯著降低(P0.05)。第14天，模型組白細胞總數、巨噬細胞和淋巴細胞較對照組明顯高(P0.01)，與溶媒干預組和SU5416晚期處理組模型組無顯著差異(P0.05)；SU5416早期處理組巨噬細胞、淋巴細胞較對照組高，低于模型、溶媒和SU5416晚期處理組(P0.05)。第28天，各組間白細胞總數和分類計數均無明顯改變(P均0.05)。 結論： 一、小鼠肺組織病理特點和Ashcroft評分說明氣管內注入博來霉素后建立肺纖維化動物模型成功，并且可用于特發(fā)性肺間質纖維化等研究。免疫組化染色示，在博來霉素誘導肺纖維化早期VEGF和Flk-1表達最高、后期很少表達，VEGF、VEGFR可能在肺纖維化形成中起重要作用。 二、熒光定量RT-PCR和ELISA提示，肺纖維化僅早期存在VEGF／Flk-1過表達，不同VEGF變異體演變趨勢相同；SU5416早期處理可有效阻斷早期Flk-1受體和VEGF過表達，F(xiàn)lk-1受體和VEGF有相同變化趨勢、SU5416阻斷VEGF受體后還可抑制VEGF過表達，說明VEGF和Flk-1間存在相互促進作用。 三、Ashcroft評分、masson染色和羥脯氨酸含量等檢測發(fā)現(xiàn)，在博來霉素誘導肺纖維化過程中，肺纖維化程度、膠原和羥脯氨酸含量呈進行性增高。早期給予SU5416可有效抑制VEGF及其受體過表達，使Ashcroft評分、膠原和羥脯氨酸含量降低。結果提示，VEGF信號在肺纖維化中有重要價值；早期給予SU5416抗肺纖維化，可能是通過抑制早期VEGF／VEGFR信號過表達實現(xiàn)。 四、經SU5416分階段干預，觀察新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表達等，模型組新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表達等指標變化趨勢與VEGF／Flk-1一致，與纖維化指標相反；早期給予SU5416有效抑制新生血管形成、TGF-β1和p-Smad3表達和VEGF／Flk-1表達。提示VEGF信號途徑在肺纖維化中可能經TGF-β1／p-Smad3途徑發(fā)揮作用；SU5416抗纖維化，可能是阻斷早期VEGF、VEGFR過表達，進而抑制TGF-β1／p-Smad3途徑實現(xiàn)。 五、通過SU5416干預，觀察LDH活力和白細胞分類計數等，發(fā)現(xiàn)模型組LDH活力和白細胞計數、分類計數變化趨勢與VEGF／Flk-1一致，與纖維化指標相反。早期給予SU5416有效降低LDH活力、巨噬細胞計數及VEGF／Flk-1表達，顯示VEGF表達與LDH、巨噬細胞計數等密切相關，提示VEGF在肺纖維化早期炎癥反應中發(fā)揮重要作用；SU5416阻斷早期VEGF／VEGFR過表達，也可能抑制了VEGF炎細胞募集及其致纖維化因子釋放。 由此可見，VEGF／VEGFR信號僅在小鼠肺纖維化形成早期過表達，且相互促進、共同參與肺纖維化過程，僅早期阻斷VEGFR能抑制肺纖維化，其機制可能是經TGF-β1／Smad3途徑和VEGF的致炎作用引起肺纖維化；SU5416抗纖維化作用很可能是阻斷VEGF／VEGFRs信號途徑后，TGF-β1／Smad3途徑和VEGF的致炎作用受抑制所致。該課題從分子水平進行研究，結果提示VEGF／VEGFR信號途徑可能是肺纖維化治療的潛在靶點，為深入臨床IPF等肺纖維化疾病治療措施研究打下了基礎。
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R563.9
【圖文】：

四川大學臨床醫(yī)學博士專業(yè)學位論文示，應用SSPS10.0統(tǒng)計軟件分析(采用勺刀。.叭吸yANOVA方差分析)，以a=0.05為檢驗水準。結果一、組織病理學表現(xiàn)大體改變:對照組小鼠肺組織呈粉紅色，濕潤、有彈性、表面光滑。模型組第7和14天雙肺見暗紅色病灶，可見較多點、片狀白色區(qū)域，肺容積開始降低;第28天小鼠肺容積減少，肺組織蒼白，表面凹凸不平，彈性明顯降低。

容積開始降低;第28天小鼠肺容積減少，肺組織蒼白，表面凹凸不平，彈性明顯降低。圖1一1.小鼠肺組織HE染色(xZoo)鏡下可見模型組第7和14天損傷分布不均勻，以胸膜下區(qū)明顯，無明顯肺組織結構破壞，肺泡間隔輕度增寬、病灶區(qū)域充血、出血、水腫

小鼠肺免疫組化VEGF表達(x400)

【參考文獻】

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1 李圣青,李煥章,楊喬欣,倪殿濤,柏常青;TGF-βRⅡ/Fc融合蛋白在桿狀病毒系統(tǒng)中的表達[J];第四軍醫(yī)大學學報;2003年04期

本文編號：2803624