【摘要】： 支氣管哮喘是一種常見病，且近年來發(fā)病率有增長趨勢。目前認為該病是由炎性細胞引起的一種氣道慢性炎癥，此種炎癥使易感者對各種激發(fā)因子具有氣道高反應性。研究支氣管哮喘的關鍵在于探明氣道高反應性的產生機理。以往，有關氣道高反應性的研究多以受體及炎性細胞為基礎，但尚不能完全解釋哮喘的發(fā)病機理。膜片鉗技術的出現(xiàn)，使人們可直接觀察細胞膜上單通道的活動，從而為哮喘的研究在分子水平上開辟了一個新領域。目前對氣管平滑肌的通道研究多集中在鉀通道上，由于其容易記錄，故研究者相對較多，而對于與興奮-收縮耦聯(lián)有密切關系的鈣離子通道的研究，由于其電導小，電流幅度較低，記錄難度大，研究者較少。細胞內鈣離子濃度的升高對增加和維持氣道平滑肌細胞收縮力起重要作用。而細胞外鈣離子主要通過電壓依賴性鈣通道(voltage dependent caicium channel，VDCC)進入細胞。鈣通道對調節(jié)支氣管平滑肌興奮-收縮耦聯(lián)起主要作用。涉及氣管平滑肌上鈣離子通道的研究工作尚不多見，迄今對其全部類型、分布、通道活動和細胞內調控因素特性仍不甚了解，更缺乏與哮喘相關的鈣通道改變的報道。當前急需用膜片鉗技術更深入地研究。其中包括：氣管平滑肌上存在的鈣通道的類型?支氣管舒張劑及免疫調節(jié)劑有無對抗作用?哪類支氣管舒張劑特異性較強?這正是本課題的研究方向，它將擴充哮喘發(fā)病機制的傳統(tǒng)概念。為尋找新型的、具有高選擇性的抗哮喘藥物亦有應用價值。 本實驗分成三個部分進行研究。 1．哮喘與缺氧大鼠模型的制作；氣管平滑肌細胞(trachea smooth muscle cell，TSMC)急性酶分離及正常情況下L型鈣通道(L-type calcium channel，Ⅰ_(Ca-L)的記錄。 2．哮喘大鼠TSMC上的Ⅰ_(Ca-L)的記錄及免疫抑制劑對Ⅰ_(Ca-L)的作用。 實驗中將雄性Waistar分為正常對照組、哮喘組、哮喘大鼠用火把花根片(Huobahuagen tablet，HBT)治療組及哮喘大鼠用地塞米松(dexamethasone，DXM)治療組共四組，分別給予相應的處理，觀測大鼠支氣管平滑肌細胞Ⅰ_(Ca-L)在正常時，哮喘發(fā)作時，以及給予HBT及DXM治療后的變化。 3.慢性缺氧(Chronieh即oxia，CH)大鼠TSMC上的I。。一L的記錄及溟 化異丙托對CH大鼠TSMC上的I。。一。的治療反應情況。 實驗中將雄性Wai star分為正常對照、缺氧組及缺氧用異丙托嗅胺處理 組共三組，分別給予相應的處理。觀測大鼠支氣管平滑肌細胞工。。一:在正常時、 缺氧時、以及缺氧后給予濱化異丙托品處理后的變化。 結果顯示: 一、TSMC的單離子通道 (一)、TSMC的分離及鑒別 取健康wistar大鼠體重30電359，以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，斷頭 處死后快速開胸取氣管立即置于含有混合氣的HPPS的溶液中清冼，去除周圍 結締組織、血管、軟骨環(huán)、刮去內膜。用HPSS液清冼2~3次。用1 .Omg.ml一‘ 鏈酶蛋白酶在36℃孵箱中消化15一ZOtnin，在此期間HPSS液中通95060:與5%C。: 的混合氣體。用HPSS清冼，徹底去除殘余的酶。用兩個針頭將氣管平滑肌分 離成絲狀，再用吸管反復吹打(10一20次)使細胞游離。將含細胞的液體吸入 離心管豎立約Zmin，讓未散開的大塊組織下沉，取上部細胞懸液置于4℃冰 箱備用.將細胞懸液分裝到涂有多聚賴氨酸的小培養(yǎng)皿中，靜置30min，選用 細胞膜完整，有立體感，梭形，折光好的細胞作通道記錄。 通過倒置顯微鏡、藥物刺激及。一aCtin抗原檢測證實為TSMC。 (二)、單通道電流幅度及電導 細胞貼附式:玻璃微電極尖端與細胞膜緊密接觸，形成高阻封接，其阻 抗數(shù)值可達10一IOOGQ，由于阻值如此之高，故基本上可看成絕緣，其上之電 流可看成零。本實驗選用阻抗值5G的電流予以記錄。 1)、去極化時，均見明顯的內向電流活動。電流幅度在同一鉗制電壓及刺激 脈沖下基本相同，呈時間不等的矩形方波。其幅度分布直方圖呈對稱的單峰 狀，并能很好地進行正態(tài)分布擬合。無論開放時程長短，通道幅度基本一致。 2)、單通道內向電流，在一定范圍內，隨去極化程度增大而縮小。根據(jù)電流- 電壓關系變化的曲線，結果顯示該通道電導為24.3PS，這與文獻報道工。。一。的 電導為25PS較一致(n二16)。 (三)、通道動力特性及鑒定 1.通道開放時間 通道開放時程直方圖均呈指數(shù)分布，且符合雙指數(shù)擬合。在一7OmV的鉗制 電壓及OmV的刺激脈沖下及控制載體為90蒯BaCI:時，兩個開放時間常數(shù)下。l (open time constant short eomponen)、T。Zt(oPen time constant long component) 分別為(0.432士0.182)ms、(2.912士1 125)ms(n=12)。 2.通道關閉時間 通道開放時程直方圖也呈指數(shù)分布。在一7OfnV的鉗制電壓及OmV的刺激脈 沖下及控制載體為90耐Bae12時，兩個關閉時間常數(shù)Te，(elose time constant short eomponent)、T eZ(elose time eonstant long co娜onent)分別為(2 008 士1 167)ms、(5.385士1.926)ms(n=12)。 3.Nifedipine的作用 對該通道有高選擇性的藥物nifedspine【‘〕去阻斷它，20一SM的nifedipine 能夠完全阻斷該通道。從而證實該通道就是工。。一
【學位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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本文編號：2802777