發(fā)布時間：2020-08-09 14:27

【摘要】：背景:大氣細顆粒物(PM)是由多種成分組成的復雜混合物,包括酸,有機化學物,金屬,土壤或灰塵顆粒。它的吸入會導致呼吸道癥狀的惡化,藥物使用頻繁,肺功能下降,氣道損傷以及死亡率的增加。然而目前仍未有藥物可以保護PM介導的氣道損傷。已有研究發(fā)現細胞自噬在PM介導的氣道損傷中起關鍵作用。細胞自噬是PM誘導氣道炎癥及黏液高分泌所必需的并且是通過NF-κB以及AP-1(activator protein 1)通路起作用。因此,我們認為自噬抑制劑(Spautin-1以及3-Methyladenine,3-MA)可能是治療PM誘導的氣道損傷的有效方法,可能為PM相關的氣道損傷提供新的預防和/或保護途徑。目的:本課題擬探討自噬抑制劑(Spautin-1以及3-MA)是否能抑制PM誘導的急性氣道炎癥,并探索可能的機制。方法:在PM干預過的人體氣道上皮細胞HBE(human bronchial epithelial cells)中分別加入自噬抑制劑(Spautin-1和3-MA),利用蛋白質印跡法(Western Blot,WB)檢測PM誘導的細胞自噬并檢測NF-κB通路相關蛋。同時利用Q-PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction)檢測分別干預自噬抑制劑(Spautin-1 或3-MA)以及PM后HBE炎癥因子的表達。在體內研究中,將6-8周雄性C57BL/6小鼠隨機分為4組,第一組為生理鹽水對照組(NS組),第二組為單純給藥組(Spautin-1或3-MA),第三組為單純PM干預組,第四組為PM+給藥組(PM+Spautin-1或PM+3-MA)。于PM最后一次干預24小時后處死小鼠,予小鼠肺泡灌洗3次,取小鼠肺泡灌洗液用光學顯微鏡觀察炎癥細胞總數及甩片染色后記錄中性粒細胞比例及絕對值,肺組織用Q-PCR及ELISA檢測炎癥因子的表達,肺組織病理HE染色觀察氣道周圍炎癥浸潤的情況。結果:(1)體外實驗證明在同時加入自噬抑制劑(Spautin-1或3-MA)和PM干預后的HBE細胞,炎癥因子IL-6,IL-8的表達比單純干預PM的HBE細胞要低,并且NF-κB通路相關蛋白p65和p-p65表達也降低。(2)體內實驗證明自噬抑制劑(Spautin-1和3-MA)能緩解PM滴注后小鼠氣道炎癥,肺泡灌洗液中炎癥細胞總數及中性粒細胞比例及絕對值明顯減少,肺組織炎癥因子顯著降低,氣道周圍炎癥浸潤明顯緩解。結論:細胞自噬抑制劑(Spautin-1和3-MA)可以通過NF-κB通路有效緩解大氣顆粒物(PM)誘導的氣道炎癥�？赡転镻M相關的氣道損傷提供新的保護方法。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：X513;R56
【圖文】：

我們用不同濃度梯度的ＰＭ干預ＨＢＥ細胞，在干預后２４ｈ收樣，用ＷＢ檢測細逡逑胞自噬ｍａｒｋｅｒＬＣ３以及ｐ６２的表達。我們發(fā)現ＬＣ３隨ＰＭ干預濃度的增加而表達逡逑增加，而ｐ６２隨ＰＭ干預濃度的增加而表達降低（圖３．１），綜上所述說明了隨著ＰＭ逡逑干預濃度的增加，細胞自噬水平增加。另外，我們用同樣濃度的ＰＭ干預ＨＢＥ細逡逑胞，發(fā)現細胞自噬水平隨著干預時間的增加而增加（圖３．２）。于此同時，透射電鏡逡逑觀察ＰＭ（１０（Ｖｇ／只）氣道滴注２天后小鼠支氣管的氣道上皮細胞，發(fā)現相較于生理逡逑鹽水組（ＮＳ組），自噬小體的數量明顯增加（圖３．３）。因此，以上結果提示ＰＭ能逡逑誘導人氣道上皮ＨＢＥ細胞以及小鼠氣道上皮細胞自噬水平的增加。逡逑Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋０邐２５邐５０邐１００逡逑（（＿ｔｇ／ｍｌ）邐邐逡逑ＬＣ３Ｉ邐＾————逡逑ＬＣ３１１邐一—邐—邐邐邐丨丨．．Ｔ逡逑邐邋…１．１．１．．．．．１邋＂邋．．邋＋邋？邋邋邐＿邋｜邋邋逡逑ｐ６２邐丨}0栜逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ邐邐邋＿丨爹邋＿＿＿＿＿＿川丨丨一邋＿丨１邋－爹逡逑圖３．１細胞自噬隨著ＰＭ干預濃度的增加而增加。用卩叼（０，２５，５０，１００呢／0１１）干預逡逑ＨＢＥ細胞２４ｈ，提取細胞總蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ檢測ＬＣ３以及ｐ６２的表達。以（３－ａｃｔｉｎ逡逑為內參。逡逑２１逡逑

邐１１５００＊逡逑ｒ邋１逡逑圖３．３體內實驗中，氣道滴注ＰＭ后小鼠氣道上皮細胞中自噬小體的數量明顯增加。逡逑ＰＭ氣道滴注２天后取小鼠氣管處理后，透射電鏡觀察小鼠支氣管氣道上皮細胞，逡逑發(fā)現相較于ＮＳ組，ＰＭ實驗組自噬小體的數量明顯增加。逡逑２２逡逑

－逡逑Ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑圖３．２細胞自噬隨著ＰＭ干預時間的增加而增加。用ＰＭ（１００ｐｇ／ｍｌ）干預ＨＢＥ細胞逡逑（０，８，１６，２４ｈ），提取細胞總蛋白，ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ檢測ＬＣ３以及ｐ６２的表達。以ｐ－ａｃｔｍ逡逑為內參。逡逑８３００＊邐１１５００＊逡逑ｒ邋１逡逑圖３．３體內實驗中，氣道滴注ＰＭ后小鼠氣道上皮細胞中自噬小體的數量明顯增加。逡逑ＰＭ氣道滴注２天后取小鼠氣管處理后，透射電鏡觀察小鼠支氣管氣道上皮細胞，逡逑發(fā)現相較于ＮＳ組，ＰＭ實驗組自噬小體的數量明顯增加。逡逑２２逡逑

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本文編號：2787243