【摘要】： 背景與目的: 海水淹溺可引起海水吸入型急性肺損傷(SW-ALI),進一步發(fā)展可導致海水型急性呼吸窘迫綜合征(SW-ARDS),病情兇險,死亡率高。由于炎癥反應(yīng)是ALI發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),人們將對ALI的研究轉(zhuǎn)向炎癥調(diào)控機制的研究,以期控制炎癥反應(yīng),減輕損傷,從而降低ALI的發(fā)病率和死亡率。蛋白酶激活受體-2(PAR2)屬G蛋白偶聯(lián)受體家族,激活后可參與炎癥反應(yīng),但在肺部炎癥反應(yīng)中的致病作用還存在爭議,在SW-AIL中的作用尚未提及,且PAR2激活后下游信號通路仍不清楚,有待進一步探討。FUT-175作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,可抑制PAR2的激活,減少炎癥介質(zhì)和細胞因子的釋放,但其抗炎作用在ALI的研究中尚未提及,有待進一步研究。為此,本課題擬從細胞水平檢測海水對A549細胞PAR2表達的影響,從分子水平探討PAR2激活后的下游信號轉(zhuǎn)導通路以及FUT-175和PAR2抗體對其下游信號通路的干預作用,從器官水平觀察FUT-175對SW-ALI大鼠肺部炎癥反應(yīng)和肺微血管通透性的影響,旨在明確PAR2在SW-ALI中的作用及機制,從抗炎的角度揭示FUT-175對SW-ALI大鼠的保護作用,為臨床應(yīng)用FUT-175治療SW-ALI提供更堅實的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 方法: 1.將培養(yǎng)的A549細胞接種于6孔板中,隨機分為對照組(control)、海水干預2、4、8、16h組,各組細胞干預相應(yīng)的時間后進行指標觀測。收集上清檢測TNF-α和IL-8濃度,收集細胞用實時熒光定量PCR法和Western blot法檢測PAR2 mRNA和蛋白表達水平。 2.將培養(yǎng)的A549細胞接種于6孔板中,隨機分為對照組(control組)、海水干預組(seawater組)、海水+PAR2抗體組(PAR2-antibody組)、海水+FUT-175組(FUT-175組)、海水+SB203580組(SB203580組)、海水+PD98059組(PD98059組)、海水+SP600125組(SP600125組)。對照組加入無血清培養(yǎng)液,海水組加入海水培養(yǎng)8h;PAR2-antibody組用PAR2單克隆抗體2mg/L預處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;FUT-175組用FUT-175 10μM預處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;SB203580組用SB203580 10μM預處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;PD98059組用PD98059 10μM預處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h;SP600125組用SP600125 0μM預處理1h后,加入海水繼續(xù)培養(yǎng)8h。control組、seawater組、PAR2-antibody組和FUT-175組收集細胞用Western印跡法和EMSA法分別檢測磷酸化p38MAPK蛋白表達量、磷酸化ERK蛋白表達量、磷酸化JNK蛋白表達量和NF-κB活化水平;各組細胞收集上清檢測TNF-α和IL-8濃度。 3.采用海水吸入法復制大鼠ALI模型,吸入海水(4ml/kg)后成功建立ALI模型。將48只Wistar大鼠隨機分為對照組、海水吸入2、4、8h組,取肺組織用實時熒光定量PCR法檢測PAR2 mRNA表達水平,用Western blot法和免疫組化法檢測PAR2蛋白表達情況。 4.采用海水吸入法和LPS吸入法復制大鼠ALI模型,96只Wistar大鼠隨機分為對照組(control)、海水組(seawater組)、LPS組(LPS組)和FUT-175治療海水吸入組(FUT-175組)。海水組和LPS組分別吸入海水(4ml/kg)和LPS(4mg/kg)建立ALI模型。seawater組:模型復制成功后20min,經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水2ml/kg。FUT-175組:海水型ALI模型復制成功后20min,經(jīng)尾靜脈注射FUT-175 10mg/kg。4組大鼠觀察8小時,分別于模型建立及干預后0.5、1、2、4、8h進行動脈血氣分析,最后檢測肺微血管通透性(PMVP)、肺濕/干重比(W/D)、肺組織髓過氧化物酶(MPO)、血漿IL-8和TNF-α水平,并觀察病理學變化。 結(jié)果: 1.與正常對照組比較,海水處理后,A549細胞PAR2 mRNA在4h時顯著升高(P0.05),隨著時間延長,在8h點達最高峰(為對照組的1.8倍),此后一直顯著高于對照組(P0.01)。A549細胞PAR2蛋白表達量也在4h時顯著升高(P0.05),在8h點達最高峰(為對照組的2.2倍),此后一直顯著高于對照組(P0.01)。A549細胞經(jīng)海水處理后,上清液中的IL-8和TNF-α迅速升高,2 h達最高峰,顯著高于對照組(P0.01)。此后有所下降,但在所有時間點均顯著高于對照組(P0.01)。 2.與正常對照組比較,海水處理后,A549細胞p38MAPK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和JNK磷酸化水平顯著升高(分別為對照組的3.1倍、1.8倍和3.2倍)(P0.01-0.05),NF-κB活化水平顯著升高(為對照組的6.7倍)(P0.01),而FUT-175和PAR2抗體預處理組同海水處理組比較,A549細胞p38MAPK磷酸化水平、JNK磷酸化水平、ERK磷酸化水平和NF-κB活化水平顯著降低(P0.01-0.05)。海水處理后,A549細胞培養(yǎng)上清液中IL-8和TNF-α顯著升高(P0.01),而FUT-175、PAR2抗體、SB203580、PD98059和SP600125預處理組同海水處理組比較,上清液中IL-8和TNF-α則顯著降低(P0.01)。 3.與正常對照組比較,海水吸入后,大鼠肺組織PAR2 mRNA和蛋白表達量在2h時即顯著升高(P0.05),隨著時間延長,在4h點達最高峰(為對照組的2.8倍),此后均顯著高于對照組(P0.01)。同時大鼠肺組織PAR2蛋白表達量在2h時即顯著升高(P0.05),隨著時間延長,在4h點達最高峰(為對照組的4.2倍),此后均顯著高于對照組(P0.01)。PAR2免疫組化顯示,在正常對照組,PAR2微弱表達于肺泡、支氣管上皮和肺泡巨噬細胞,海水吸入2h后,陽性反應(yīng)明顯增強,不僅見于肺泡和支氣管上皮細胞,還見于肺微血管內(nèi)皮細胞和氣道平滑肌細胞。 4.與正常對照組比較,海水和LPS吸入致傷組大鼠PaO2下降、W/D比值增大、肺微血管通透性增高、肺組織MPO活性增高、血漿IL-8和TNF-α升高、肺組織病理形態(tài)學積分增加(P0.01);海水組PaO2明顯低于LPS組,而MPO、W/D和PVMP明顯高于LPS組(P0.01)。FUT-175治療海水吸入組上述指標均顯著改善(P0.01-0.05)。 結(jié)論: 1.海水處理A549細胞,可上調(diào)A549細胞PAR2的表達,導致IL-8和TNF-α釋放的增加,同時可導致A549細胞結(jié)構(gòu)的改變。 2.海水激活A549細胞PAR2后,通過MAPK信號通路和NF-B信號通路,導致IL-8和TNF-α釋放增加,是海水處理A549細胞導致細胞損傷的可能機制。 3.絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175和PAR2抗體可通過抑制PAR2的激活,對海水處理的A549具有保護作用。 4.海水吸入后大鼠肺組織PAR2表達上調(diào),在海水所致急性肺損傷中起重要作用。 5.絲氨酸蛋白酶抑制劑FUT-175對海水吸入所致急性肺損傷大鼠具有保護作用,其機制可能是通過抑制肺組織PAR2的激活,阻斷其下游的炎癥反應(yīng),減輕肺損傷,降低肺血管通透性,減輕肺水腫。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R649.3;R563.8

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本文編號：2782730