本文關鍵詞：RIP140對膿毒癥急性肺損傷PPARγ調控作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：ALI/ARDS(急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征)是臨床常見的危急重癥,是由各種因素導致彌漫性肺泡-毛細血管膜損傷,進而引起以非心源性肺水腫和炎癥為病理特征的急性呼吸衰竭。雖然經(jīng)過幾十年的臨床和基礎研究,但目前尚無十分有效的針對ALI/ARDS的治療措施,其病死率依然高達40%以上[1]。因此,深入研究ALI/ARDS的發(fā)病機制,尋找新的有效的治療方法和新藥開發(fā)是目前ALI/ARDS的主要研究方向。過氧化物酶增殖體激活受體γ(Perroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)是核受體超家族一員[2]。研究表明,PPARγ的表達或活性增強后可產生強力有效的抗炎作用抑制ALI/ARDS過激的炎癥反應,從而減輕病理損傷對機體產生保護作用,因此有學者認為PPARγ有可能成為ALI/ARDS的一新的治療靶點[3~6]。但在ALI/ARDS的發(fā)病過程中通常伴隨著PPARγ的表達及活性下降,其具體調控機制不明[6,7]。受體相互作用蛋白(Receptor interacting protein 140,RIP140)是PPARγ的一轉錄輔助抑制因子,對PPARγ的活性起負調控作用[8,10]。但目前仍不清楚在ALI/ARDS的發(fā)病過程中RIP140與PPARγ的相互關系以及其是否對PPARγ的表達和活性具有調節(jié)作用。因此,本研究中我們首先研究了RIP140在ALI/ARDS時肺組織中及巨噬細胞的表達變化,在此基礎上通過基因技術下調RIP140表達觀察對PPARγ表達和活性的影響。從輔助因子層面探討了PPARγ的上游調控機制,為PPARγ今后在ALI/ARDS的進一步運用提供理論基礎。目的:探討膿毒癥肺損傷時RIP140對PPARγ的調控作用,闡明在ALI/ARDS時PPARγ的上游調控機制。方法:1.膿毒癥急性肺損傷RIP140在肺組織中的表達研究通過盲腸結扎穿孔術復制大鼠膿毒癥肺損傷模型;隨后,使用免疫組化技術、Western-blot、激光共聚焦技術觀察在膿毒癥肺損傷時RIP140在肺組織中的表達及定位。2.RIP140對巨噬細胞炎癥應答時PPARγ表達及活性的調控研究Western-blot技術觀察在LPS刺激后RAW264.7巨噬細胞內RIP140和PPARγ的表達變化。在此基礎上,構建rip140shrna腺病毒載體,轉染體外培養(yǎng)的raw264.7巨噬細胞,使用rt-pcr、westernblot、elisa觀察在巨噬細胞炎癥反應過程中下調rip140的表達對pparγ表達活性及對下游炎性因子的表達影響。3.下調rip140的表達對小鼠膿毒癥急性肺損傷肺組織炎癥反應的影響首先,通過腹腔注射lps復制小鼠膿毒癥肺損傷,westernblot檢測rip140和pparγ的表達變化規(guī)律。隨后,通過體內轉染技術下調rip140的表達,westernblot檢測膿毒癥肺損傷時下調rip140對pparγ表達的影響,rt-qpcr、he染色觀察下調rip140是否通過pparγ影響肺組織炎性因子表達及病理損傷。結果:1.成功的復制了膿毒癥肺損傷動物模型,在正常大鼠及假手術組大鼠的肺泡巨噬細胞中rip140呈一較低表達水平。而clp后6h,rip140的表達水平較對照組開始升高(p㩳0.05)至12~24h維持一較高水平(p㩳0.05)。通過激光共聚焦免疫熒光進一步發(fā)現(xiàn)rip140主要表達于胞核。2.lps刺激6h后巨噬細胞中rip140的表達較0h組開始上升(p0.01),至12~24h維持在一較高的表達水平。在rip140表達升高的同時pparγ的表達開始下降(p0.01)至12h其表達水平降至最低(p0.05)。通過基因技術下調rip140的表達后pparγ的表達及活性即恢復,這一效應可被pparγ阻斷劑gw9662所抑制。下調rip140的表達可明顯抑制il-1β、tnf-α、il-6mrna的表達及釋放,而這一抗炎效應可被gw9662抑制。3.在lps刺激后6h小鼠肺組織中rip140的表達較0h,3h組開始升高(p0.05),并持續(xù)至24h。與此相反的是,在lps刺激后6h肺組織中pparγ的表達水平較0h,3h組開始下降(p0.05)至12~24h為此一較低的水平。通過rip140shrna腺病毒載體下調小鼠肺組織rip140表達發(fā)現(xiàn):rip140shrna+lps組小鼠肺組織中il-1β、tnf-α、il-6mrna表達水平明顯低于空載體+lps組(p0.05),但在使用pparγ阻斷劑gw9662后這些促炎基因的表達水平的明顯高rip140shrna+lps組(p0.05)。通過he染色我們進一步證實:rip140shrna+lps組小鼠肺組織病理損傷明顯低于空載體+lps組,但這一保護作用可明顯被pparγ阻斷劑gw9662逆轉結論:1.膿毒癥肺損傷時rip140在肺組織中主要表達于炎性細胞,通過體外分離培養(yǎng)膿毒癥肺損傷大鼠現(xiàn)肺泡巨噬細胞進一步發(fā)現(xiàn)rip140在肺泡巨噬細胞的表達水平明顯升高且其主要表達于胞核;2.成功的構建了對細胞毒性作用小轉染效率高的腺病毒載體,通過該載體攜帶的RIP140shRNA可有效下調肺泡巨噬細胞RIP140表達;下調巨噬細胞RIP140的表達可恢復炎癥應答過程中PPARγ的表達及活性,從細胞水平證實了RIP140對PPARγ的表達及活性存在調控作用;同時還發(fā)現(xiàn),下調巨噬細胞RIP140的表達可通過增強PPARγ的表達及活性,抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表達及釋放。3.通過體內轉染證實:在ALI/ARDS時下調肺組織中RIP140的表達可明顯升高PPARγ的表達水平,進而抑制肺組織中促炎基因的表達減輕肺組織病理損傷。從體內水平證實了RIP140對PPARγ的表達及活性存在調控作用。
【關鍵詞】：受體相互作用蛋白 RIP140 膿毒癥 ALI/ARDS 急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R459.7;R563.8
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 膿毒癥急性肺損傷肺組織中RIP140 表達研究14-27
• 2.1 材料與方法14-22
• 2.2 結果22-25
• 2.3 討論25-26
• 2.4 小結26-27
• 第三章 RIP140 對巨噬細胞PPARγ 表達及活性調控作用的研究27-42
• 3.1 材料與方法28-36
• 3.2 結果36-40
• 3.3 討論40-41
• 3.4 小結41-42
• 第四章 RIP140 對膿毒癥急性肺損傷肺組織炎癥反應的影響42-51
• 4.1 材料與方法42-47
• 4.2 結果47-50
• 4.3 討論50
• 4.4 小結50-51
• 全文結論51-52
• 參考文獻52-57
• 文獻綜述 RIP140 與炎癥相關研究進展57-66
• 參考文獻62-66
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的論文66-67
• 致謝67

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