【摘要】：一、COPD大鼠外周血EPCs功能變化目的復(fù)制COPD大鼠模型,提取大鼠外周血EPCs體外培養(yǎng)并鑒定,觀察COPD對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移、周期和凋亡功能的影響。方法應(yīng)用熏煙聯(lián)合氣管注入內(nèi)毒素干預(yù)健康雄性SD大鼠復(fù)制COPD模型,通過對(duì)肺泡灌洗液炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)和肺組織病理染色判斷COPD模型是否構(gòu)建成功。腹主動(dòng)脈采血后用密度梯度離心法從大鼠外周血中獲取單個(gè)核細(xì)胞,將其接種在加有細(xì)胞載玻片的六孔板上,應(yīng)用EBM-2專用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,待細(xì)胞貼壁分化后,通過FITC標(biāo)記的UEA-1的吸附和內(nèi)吞Dil-ac-LDL鑒定細(xì)胞。應(yīng)用CCK-8試劑盒鑒定EPCs增殖和黏附功能,應(yīng)用transwell觀察細(xì)胞遷移功能,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測EPCs周期和凋亡情況。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS.20統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果通過煙熏聯(lián)合注射LPS方法,肺泡灌洗液炎細(xì)胞計(jì)數(shù)和病理結(jié)果證明COPD大鼠模型成功復(fù)制;經(jīng)FITC標(biāo)記的UEA-1的吸附和內(nèi)吞Dil-ac-LDL鑒定出分離培養(yǎng)細(xì)胞的為EPCs。通過CCK-8方法測得COPD大鼠組EPCs的增殖能力較對(duì)照組顯著降低(P0.01);黏附實(shí)驗(yàn)測得COPD組EPCs的黏附能力較對(duì)照組顯著降低(P0.01);transwell測得COPD組EPCs的遷移能力較對(duì)照組顯著降低(P0.00);COPD組較對(duì)照組G_0G_1期EPCs顯著增多(P0.01),S期和G_2M期EPCs顯著減少(P0.01;P0.05);COPD組EPCs凋亡率明顯高于對(duì)照組(P0.05)。結(jié)論COPD大鼠外周血中EPCs增殖,遷移、粘附功能降低,細(xì)胞周期多阻滯在G_0G_1期,S期和G_2M期細(xì)胞減少,細(xì)胞凋亡率顯著增加。二、Sirt1對(duì)EPCs增殖、遷移、黏附、周期及凋亡的影響第一節(jié)EPCs表達(dá)Sirt1目的明確Sirt1在EPCs中表達(dá)。方法體外培養(yǎng)COPD大鼠組及對(duì)照組外周血EPCs,通過PCR、Westernblot及細(xì)胞免疫熒光的方法測定EPCs表達(dá)Sirt1。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS.20統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果COPD大鼠EPCs上Sirt1mRNA的表達(dá)顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P0.01)。COPD組和對(duì)照組EPCs細(xì)胞均可檢Sirt1蛋白條帶,經(jīng)WCIF ImageJ圖像分析軟件分析,以β-actin標(biāo)化后的COPD大鼠細(xì)胞Sirt1蛋白表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組細(xì)胞(P0.01)。COPD大鼠和對(duì)照組Sirt1在共聚焦顯微鏡下觀察:兩組細(xì)胞均表達(dá)Sirt1,Sirt1在COPD大鼠熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組。結(jié)論Sirt1在COPD組及對(duì)照組EPCs內(nèi)均有表達(dá),且COPD組顯著低于對(duì)照組。第二節(jié)Sirt1對(duì)EPCs增殖、遷移、黏附、周期及凋亡的影響目的觀察Surt1對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移、周期和凋亡功能的影響。方法應(yīng)用Sirt1的激動(dòng)劑(SRT1720)和攜有Sirt1病毒慢病毒的轉(zhuǎn)染EPCs方法使Sirt1過表達(dá)稱為激動(dòng)劑組,應(yīng)用Sirt1抑制劑(EX527)降低EPCs內(nèi)Sirt1表達(dá)稱為抑制劑組,應(yīng)用CCK-8試劑盒鑒定EPCs增殖和黏附功能,應(yīng)用并通過transwell小室觀察細(xì)胞遷移功能,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測EPCs周期和凋亡情況。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS.20統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果激動(dòng)劑和攜帶Sirt1慢病毒轉(zhuǎn)染提高Sirt1表達(dá)后EPCs增殖能力較COPD組顯著增加(P0.05;P0.05),抑制劑組增殖能力較COPD組顯著降低(P0.05)。激動(dòng)劑組EPCs的黏附能力較COPD顯著增加(P0.01),抑制劑組黏附能力較COPD組降低,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。激動(dòng)劑組EPCs的遷移能力較COPD顯著降低(P0.0001),抑制劑組遷移能力較COPD組顯著降低(P0.001)。激動(dòng)劑組較COPD組G_0G_1期EPCs顯著減少(P0.001),S期和G_2M期EPCs顯著增多(P0.01;P0.01),抑制劑組較COPD組G_0G_1期EPCs顯著增加(P0.05),S期和G_2M期EPCs減少,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05;P0.05)。激動(dòng)劑組EPCs凋亡率較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組EPCs凋亡率較COPD組顯著增高(P0.01)。結(jié)論Sirt1過表達(dá)時(shí)對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移功能具有促進(jìn)作用,細(xì)胞凋亡減少,Sirt1表達(dá)降低時(shí)會(huì)抑制EPCs增殖、黏附、遷移功能具有促進(jìn)作用,細(xì)胞凋亡增加。三、Sirt1對(duì)NF-KB,FOXO3a,P53基因的影響目的通過改變Sirt1表達(dá)后觀察COPD大鼠的EPCs Sirt1、FOXO3a、p53及NF-kB的表達(dá),并觀察COPD和對(duì)照大鼠肺組織內(nèi)Sirt1及FOXO3a,p53,NF-kB的表達(dá),探討Sirt1和FOXO3a、NF-KB、P53之間的關(guān)系。方法提取對(duì)照組、COPD組、激動(dòng)劑組和抑制劑組EPCs的mRNA、蛋白質(zhì)通過qPCR方法和蛋白印跡方法檢測EPCs內(nèi)Sirt1、FOXO3a、NF-KB及P53的表達(dá),并制備細(xì)胞爬片,通過免疫熒光的方法觀察Sirt1在EPCs的表達(dá)。將復(fù)制成功的COPD大鼠和正常組大鼠肺組織取出后分別提取RNA、蛋白質(zhì)和制成石蠟包塊;通過qPCR方法、蛋白印跡方法和免疫熒光的方法檢測肺組織內(nèi)Sirt1、FOXO3a、NF-KB及P53的表達(dá)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)用SPSS.22統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)以(?)±s表示,組間比較采用t-test,P0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果通過qPCR測得COPD組中EPCs Sirt1的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(P0.01),激動(dòng)劑組Sirt1 mRNA的表達(dá)量較COPD組顯著增高(P0.01),抑制劑組Sirt1 mRNA表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.05);通過qPCR測得COPD組中EPCs FOXO3a的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(P0.01),激動(dòng)劑組FOXO3a mRNA的表達(dá)量較COPD組顯著增高(P0.01),抑制劑組FOXO3a mRNA表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.05);通過qPCR測得COPD組中EPCs NF-KB的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P0.01),激動(dòng)劑組NF-KB mRNA的表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組NF-KB mRNA表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.0001);通過qPCR測得COPD組中EPCs P53的mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P0.001),激動(dòng)劑組P53 mRNA的表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.001),抑制劑組P53 mRNA表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.01)。通過Western blote測得COPD組中EPCs Sirt1蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(P0.01),激動(dòng)劑組Sirt1蛋白表達(dá)量較COPD組顯著增高(P0.05),抑制劑組Sirt1蛋白表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.01);通過Western blote測得COPD組中EPCs FOXO3a蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低(P0.01),激動(dòng)劑組FOXO3a蛋白表達(dá)量較COPD組顯著增高(P0.01),抑制劑組FOXO3a蛋白表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.01);通過Western blote測得COPD組中EPCs NF-KB蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P0.05),激動(dòng)劑組NF-KB蛋白表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組NF-KB蛋白表達(dá)量較COPD組增高,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);通過Western blote測得COPD組中EPCs P53蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(P0.01),激動(dòng)劑組P53蛋白表達(dá)量較COPD組顯著降低(P0.05),抑制劑組P53蛋白表達(dá)量較COPD組顯著增高(P0.01)。通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察到COPD組Sirt1在EPCs表達(dá)較對(duì)照組降低,激動(dòng)劑組Sirt1在EPCs中的表達(dá)較COPD組顯著,抑制劑組Sirt1在EPCs中的表達(dá)較COPD組降低;通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察到COPD組FOXO3a在EPCs表達(dá)較對(duì)照組降低,激動(dòng)劑組FOXO3a在EPCs中的表達(dá)較COPD組增加,抑制劑組FOXO3a在EPCs中的表達(dá)較COPD組降低;通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察到COPD組NF-KB在EPCs表達(dá)較對(duì)照組增加,激動(dòng)劑組NF-KB在EPCs中的表達(dá)較COPD組降低,抑制劑組NF-KB在EPCs中的表達(dá)較COPD組增加;通過細(xì)胞免疫熒光方法觀察到COPD組P53在EPCs表達(dá)較對(duì)照組增加,激動(dòng)劑組P53在EPCs中的表達(dá)較COPD組降低,抑制劑組P53在EPCs中的表達(dá)較COPD組增加。同時(shí)我們測定COPD組肺組織Sirt1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著低降低(P0.05),COPD組FOXO3a肺組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量也顯著低于對(duì)照組(P0.05),NF-KB在肺組織中Sirt1 mRNA的表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P0.001);而P53的mRNA在肺組織中的表達(dá)量也顯著高于對(duì)照組。COPD組大鼠肺組織中SIRT1蛋白質(zhì)的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P0.05);FOXO3a在肺組織中的表達(dá)量也顯著低于對(duì)照組(P0.05);而NF-KB蛋白表達(dá)量COPD組顯著高于對(duì)照組(P0.0001);P53在COPD組大鼠肺組織的表達(dá)量是顯著降低的(P0.05)。通過免疫熒光方法測定COPD組肺組織內(nèi)SIRT1的表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P0.001);COPD組肺組織內(nèi)FOXO3a表達(dá)量較對(duì)照組顯著降低(P0.001),COPD組NF-KB表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高(P0.001),COPD組P53的表達(dá)量較對(duì)照組的表達(dá)量也是顯著升高的(P0.05)。結(jié)論Sirt1對(duì)EPCs功能的影響主要是通過Sirt1/FOXO3a/NF-KB/P53信號(hào)通路,但是在COPD大鼠體內(nèi)P53蛋白可能還受其它蛋白調(diào)控。
【圖文】：

細(xì)胞的可用于以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。但是）圖 1-5。圖1-5 EPCs細(xì)胞生長曲線FITC-UEA-I和 96h 測定可用于以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。但是 COPD 組生長

浸洗爬片 3 次，1 次/3min；（7）復(fù)染核：滴加 DAPI 避光室溫孵育 5min 后用 PBST 5min×4 次洗去多余的 DAPI；（8）用吸水紙吸干 PBST，用指甲油封片，然后在共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。2.1.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用 SPSS20 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以 x±s 表示，組間比較采用 t-test，，P< 0.05 代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.1.2 結(jié)果2.1.2.1 EPCs 中 Sirt1 mRNA 的表達(dá)通過對(duì) qPCR 方法測定 COPD 組 EPCs 中 Sirt1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均有表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組表達(dá)較對(duì)照組顯著低降低（P＜0.01），可見圖 1，2；圖 2-1
【學(xué)位授予單位】：海南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R563.9

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本文編號(hào)：2687044