【摘要】：第一部分超表達(dá)STAT4和STAT6穩(wěn)定Jurkat細(xì)胞系的建立 目的:構(gòu)建STAT4及STAT6超表達(dá)Jurkat穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,以便向該細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒導(dǎo)致STAT4、STAT6和CBP基因沉默,觀察轉(zhuǎn)錄因子STAT4、STAT6及CBP在Jurkat細(xì)胞中的相互效應(yīng)。 方法:使用DMRIE-C分別將質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞,并利用質(zhì)粒編碼蛋白中的Neo/Kan酶活性,使用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)STAT4及STAT6的穩(wěn)定細(xì)胞系。 結(jié)果:①質(zhì)粒與DMRIE-C最佳比例隨細(xì)胞接種密度改變而發(fā)生變化。②當(dāng)接種Jurkat細(xì)胞為2.5×105/cm~2時(shí),G418 500 mg/ml為合理的穩(wěn)定篩選濃度。③在G418篩選下,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP、pIRES2-EGFP-STAT4和pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細(xì)胞,其GFP表達(dá)高峰分別在轉(zhuǎn)染后第3~4天、第6~7天和第9天出現(xiàn)。④使用脂質(zhì)體DMRIE-C轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,2.5×105/cm~2組與1.5×10~5/cm~2組轉(zhuǎn)染率相差不大。⑤經(jīng)G418篩選,1.5×105/cm~2組篩出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,但是2.5×10~5/cm~2組未篩出。⑥轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細(xì)胞經(jīng)G418篩選,出現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pIRES2-EGFP-STAT6的Jurkat細(xì)胞則未篩選出任何克隆。 結(jié)論:經(jīng)過DMRIE-C轉(zhuǎn)染和G418篩選,發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒表達(dá)的一些特點(diǎn),獲得了穩(wěn)定篩選的一些經(jīng)驗(yàn),轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-STAT6質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞出現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆,但轉(zhuǎn)染STAT4質(zhì)粒的Jurkat細(xì)胞因轉(zhuǎn)染率過低未能篩選出穩(wěn)定細(xì)胞系。 第二部分Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞條件的優(yōu)化 目的:優(yōu)化陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞Jurkat的條件,以建立更為有效的轉(zhuǎn)染方案。 方法:把帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因的兩種質(zhì)粒pIRES2-EGFP和pIRES2-EGFP-STAT6作為基因載體,采用Lipofectamine? LTX轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染狀態(tài)、脂質(zhì)體與DNA的比例、細(xì)胞接種密度、不同量培養(yǎng)基等對(duì)轉(zhuǎn)染效果的影響,比較瞬時(shí)轉(zhuǎn)染效果。 結(jié)果:Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)速度與細(xì)胞密度密切相關(guān),轉(zhuǎn)染前1 d換液,可保證細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài),培養(yǎng)基新鮮度對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響不大。Lipofectamine? LTX體積與質(zhì)粒質(zhì)量之比為2.75μl:500 ng時(shí),其轉(zhuǎn)染效果明顯優(yōu)于其他各組;適當(dāng)加大轉(zhuǎn)染時(shí)Jurkat細(xì)胞的鋪板密度,可以明顯提高轉(zhuǎn)染試劑的利用率;轉(zhuǎn)染48 h后,300μl/孔組的熒光陽(yáng)性率是600μl/孔組的(1.4±0.2)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染后24 h,各比例組(按照Lipofectamine(?) LTX體積與質(zhì)粒質(zhì)量分組)轉(zhuǎn)染效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);轉(zhuǎn)染48 h后,各比例組轉(zhuǎn)染效果差異顯著(P 0.05),且Lipofectamine(?) LTX轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:對(duì)Lipofectamine(?) LTX轉(zhuǎn)染懸浮細(xì)胞Jurkat做出了一些建設(shè)性意見,并闡述了轉(zhuǎn)染后基因的一些表達(dá)規(guī)律,以期對(duì)懸浮細(xì)胞的轉(zhuǎn)染提供相關(guān)參考。 第三部分STAT4、STAT6及CBP相應(yīng)基因沉默在Jurkat細(xì)胞中的相互影響觀察 目的:利用基因沉默技術(shù),觀察由此引起的效應(yīng),并分析轉(zhuǎn)錄因子STAT4、STAT6及CBP在基因轉(zhuǎn)錄之間的相互關(guān)系。 方法:使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine(?) LTX分別將質(zhì)粒pGenesil-3-shSTAT4、pGenesil-3-shSTAT6或pGenesil-3-shCBP與檢測(cè)質(zhì)粒pGL3-IL-4R和pCAT3-IFN-γ共轉(zhuǎn)染入Jurkat細(xì)胞,用IL-12和IL-4激活Jak-STATs信號(hào)通路,利用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶ELISA試劑盒檢測(cè),觀察靶基因的活性。 結(jié)果:基因CBP的沉默可以導(dǎo)致基因IL4R和IFNG啟動(dòng)子活性的下降,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有意義(P0.05);基因STAT4和STAT6的沉默所得結(jié)果沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論:①CBP是啟動(dòng)基因IL4R和IFNG轉(zhuǎn)錄的重要輔助分子;②CBP在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)是有限的;③在人和小鼠細(xì)胞中的CBP結(jié)構(gòu)可能高度保守。④轉(zhuǎn)錄因子STAT4和STAT6之間的相互關(guān)系暫時(shí)無(wú)法確定。
【圖文】：

向效應(yīng)亞群 Th1 和 Th2 分化過程中，受調(diào)節(jié)性轉(zhuǎn)錄因子 STATs 的嚴(yán)，STAT6 和 STAT4 分別對(duì) Th2 和 Th1 細(xì)胞的增殖和分化具有關(guān)鍵性作效應(yīng)性和記憶性 Th2 細(xì)胞的存活都是必需的[3]。STAT6 基因敲除的 Th2 細(xì)胞，且有嚴(yán)重的 IgE 分泌缺陷[11]�；罨銐虻� STAT6 不但能h2 分化，甚至還會(huì)逆轉(zhuǎn) Th0 細(xì)胞向 Th1 分化的趨勢(shì)[3]。在 STAT4 基內(nèi)，Th0 細(xì)胞缺失了向 Th1 細(xì)胞分化的能力，反而顯示出向 Th2 細(xì)[23]。見表 1-1。由于STAT4和STAT6對(duì)Th1和 Th2細(xì)胞分化具有的這種舉足輕重的時(shí)，考慮到 Jurkat 轉(zhuǎn)染率較低，直接將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入 Jurkat 細(xì)胞可理想的統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)，因此迫切需要構(gòu)建 STAT4 和 STAT6 的穩(wěn)定超表穩(wěn)定超表達(dá)的基礎(chǔ)上進(jìn)行基因沉默，以利于進(jìn)一步研究。

于 Jurkat 細(xì)胞難以轉(zhuǎn)染，，本實(shí)驗(yàn)選用了專門用于懸浮細(xì)胞、可進(jìn)行穩(wěn)定離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑——DMRIE-C[25 27]。離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染機(jī)理[28]：陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒相遇后迅速通過靜電作用脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變, 最終完全包裹住質(zhì)粒, 形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合體。脂復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的途徑目前認(rèn)為有 3 種模式：與細(xì)胞質(zhì)膜融合方式、細(xì)直接滲透。其中，胞吞作用被認(rèn)為是復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞的主要機(jī)制。進(jìn)入質(zhì)粒從復(fù)合物分離出來(lái)，啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮轉(zhuǎn)染效力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R562.25

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 許呂宏;方建培;翁文駿;徐宏貴;張亞停;;黏著斑激酶基因沉默靶向治療白血病的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2011年03期

2 張娜;錢悅;馮愛平;;RNA干擾分子機(jī)制的研究進(jìn)展及其在黑素瘤中的應(yīng)用[J];醫(yī)學(xué)綜述;2011年10期

3 許呂宏;方建培;王英;翁文駿;;FAK基因沉默增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物敏感性[J];中國(guó)病理生理雜志;2011年07期

4 李波;劉呈祥;王靜;丁兆習(xí);;拉帕替尼和AZD0530聯(lián)合化療對(duì)PTEN低表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的作用[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2011年06期

5 郭啟帥;黃曦;李少林;;沉默PeroxiredoxinⅠ基因增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞放射敏感性及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2011年16期

6 羅yN;姚珍薇;楊雅瑩;易永芬;;人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞株A2780凋亡的影響及其機(jī)制[J];中國(guó)生物制品學(xué)雜志;2011年07期

7 辛彩霞;左自立;宋本艷;藍(lán)秀;王超;王鴻程;;STAT4與Bax、c-myc在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J];瀘州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年05期

8 王愛麗;吳志宏;徐順;顧耀輝;黃靜;陳波;賈卿;;Smad3基因siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及沉默效應(yīng)[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2011年28期

9 王會(huì)玲;許燁;張金元;;肌肉萎縮蛋白Fbox-1基因沉默對(duì)糖皮質(zhì)激素作用下肌管萎縮的影響[J];腎臟病與透析腎移植雜志;2011年01期

10 許乾乾;衛(wèi)瑩;肖衛(wèi)華;凌斌;周穎;;沉默p53的表達(dá)對(duì)婦科腫瘤細(xì)胞系中STAT3的表達(dá)影響[J];中國(guó)腫瘤;2011年08期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 謝岷;俞燕;朱珊;賀鈺磊;許望瓊;曹勵(lì)之;;HMGB1基因沉默對(duì)阿霉素誘導(dǎo)K562/A02細(xì)胞凋亡增敏作用的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第五次全國(guó)兒科中青年學(xué)術(shù)交流大會(huì)論文匯編（上冊(cè)）[C];2008年

2 高燕;張厚德;杜冀暉;;RNA介導(dǎo)survivin基因沉默對(duì)胰腺癌細(xì)胞株凋亡及增殖的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（上冊(cè)）[C];2007年

3 陳岐輝;盧績(jī);姜鳳鳴;王春喜;;HIWI基因沉默對(duì)膀胱癌細(xì)胞抑制的研究[A];第十五屆全國(guó)泌尿外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2008年

4 辛佳璇;劉斌;徐春曉;劉賢錫;;S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因沉默抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的研究[A];山東生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

5 季愛民;蘇丹;車鷗;李文適;孫靚;張忠義;楊彬;;殼聚糖/siRNA納米粒介導(dǎo)的功能性基因沉默研究(英文)[A];2010年中國(guó)藥學(xué)大會(huì)暨第十屆中國(guó)藥師周論文集[C];2010年

6 李蔚;吳素蘭;林q煌;周天鴻;曾志鋒;;EGS564基因沉默HCMV UL49表達(dá)及其抗病毒活性的研究[A];中國(guó)的遺傳學(xué)研究——遺傳學(xué)進(jìn)步推動(dòng)中國(guó)西部經(jīng)濟(jì)與社會(huì)發(fā)展——2011年中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)大會(huì)論文摘要匯編[C];2011年

7 霍艷英;王瑩;張開泰;王莉;項(xiàng)曉瓊;胡迎春;徐勤枝;李剛;米粲;吳德昌;;Smad7基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的影響[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)毒理專業(yè)委員會(huì)第十次學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

8 袁誠(chéng);李萃;馬金;韓成貴;于嘉林;Andrew Jackson;李大偉;;大麥條紋花葉病毒誘導(dǎo)的基因沉默載體系統(tǒng)的改造及其應(yīng)用[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2009年

9 曹雪松;肖奇;周鵬;張曉明;魏春紅;李毅;;水稻矮縮病毒編碼的基因沉默抑制因子及其作用機(jī)制的研究[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)暨植物病理學(xué)報(bào)創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會(huì)論文摘要集[C];2005年

10 曹雪松;肖奇;周鵬;張曉明;魏春紅;李毅;;水稻矮縮病毒編碼的基因沉默抑制因子及其作用機(jī)制的研究[A];中國(guó)植物病理學(xué)會(huì)2005年學(xué)術(shù)年會(huì)暨植物病理學(xué)報(bào)創(chuàng)刊50周年紀(jì)念會(huì)論文集[C];2005年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 肖嶸　蘇玉文 湛意;將基因沉默理論用于硬皮病[N];健康報(bào);2007年

2 余志平;siRNA治療研究異彩紛呈(上)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

3 實(shí)習(xí)生 吳麗華;周雪平：8億農(nóng)民讓我留在國(guó)內(nèi)[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

4 本版編輯 顏亮 楚君　任海軍;“沉默”是金[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2006年

5 記者 高博;胚胎干細(xì)胞分化方式被確定[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

6 聶翠蓉編譯;RNAi：生物技術(shù)的藍(lán)月亮[N];科技日?qǐng)?bào);2003年

7 肖兵;攻關(guān)鎖定害蟲抗藥性、作物抗病性[N];農(nóng)資導(dǎo)報(bào);2007年

8 谷文;百奧邁科與Benitec開發(fā)新型小核酸干擾抗乙肝藥物[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

9 醫(yī)學(xué)博士 科學(xué)松鼠會(huì)成員 致樺;美麗的干擾[N];中國(guó)經(jīng)營(yíng)報(bào);2010年

10 記者：劉莉 實(shí)習(xí)生：吳麗華;從“根”上給農(nóng)作物“治病治蟲”[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 李洪海;應(yīng)用RNAi技術(shù)對(duì)肝癌癌基因p28～(GANK)生物學(xué)功能的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 呂典秋;馬鈴薯紡錘塊莖類病毒遺傳多樣性及其誘導(dǎo)的基因沉默[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

3 牛勝鳥;病毒基因介導(dǎo)的抗性機(jī)制及抗病毒轉(zhuǎn)基因西瓜的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

4 陶小榮;中國(guó)番茄黃化曲葉病毒（TYLCCNV）致病分子機(jī)理及其衛(wèi)星DNA誘導(dǎo)的基因沉默研究[D];浙江大學(xué);2004年

5 徐凱成;利用RNA干擾抑制人肝癌細(xì)胞N-ras表達(dá)的研究[D];吉林大學(xué);2006年

6 張華建;三種激發(fā)子誘導(dǎo)的過敏性細(xì)胞死亡和氣孔關(guān)閉的分子機(jī)制研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2009年

7 張新民;原沉默子及染色質(zhì)重構(gòu)蛋白對(duì)基因沉默和異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用[D];吉林大學(xué);2011年

8 王成勤;Kif2a基因沉默抑制舌鱗狀細(xì)胞癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的研究[D];山東大學(xué);2011年

9 鄧緒芳;p53在日本腦炎病毒復(fù)制及其致病性中的作用[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2011年

10 王長(zhǎng)春;番茄Cf-4和Cf-9基因介導(dǎo)的過敏性反應(yīng)調(diào)控及基因沉默技術(shù)的研究[D];浙江大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 牛超;Jurkat細(xì)胞中STAT4、STAT6及CBP基因沉默在Jak-STATs通路中的相互作用研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2011年

2 任s

本文編號(hào)：2675297