【摘要】：目的:肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)廣泛分布于自然界,為條件致病菌,40%～50%健康人群鼻咽部可攜帶本菌。當(dāng)機(jī)體處于免疫力低下狀態(tài)時(shí),引起細(xì)菌性肺炎、腦膜炎、中耳炎以及敗血癥,在嬰幼兒和老年感染患者中具有一定的死亡率。據(jù)統(tǒng)計(jì)在發(fā)展中國(guó)家,每年約有120萬(wàn)5歲以下的兒童死于肺炎鏈球菌引起的肺炎。肺炎鏈球菌感染性疾病的快速診斷實(shí)驗(yàn)對(duì)早期對(duì)癥治療,減少抗生素的濫用,降低發(fā)病率和死亡率具有重要的意義。本研究通過(guò)基因工程技術(shù)獲取肺炎鏈球菌表面蛋白自溶素(LytA)和膽堿結(jié)合蛋白(CbpA),探討其對(duì)肺炎鏈球菌感染小鼠的血清學(xué)診斷價(jià)值,為進(jìn)一步應(yīng)用于臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法: 1.lytA和cbpA基因的原核表達(dá)及純化:根據(jù)GenBank中l(wèi)ytA和cbpA基因保守序列設(shè)計(jì)合成特異性引物,采用PCR技術(shù)從肺炎鏈球菌基因組中擴(kuò)增lytA和cbpA保守序列片段;經(jīng)由IPTG誘導(dǎo)并通過(guò)等電點(diǎn)洗脫方法獲取純化的重組蛋白LytA和CbpA;Western blot測(cè)定表達(dá)蛋白的抗體結(jié)合活性。 2.建立細(xì)菌感染小鼠模型:肺炎鏈球菌感染實(shí)驗(yàn)組及乙型鏈球菌感染對(duì)照組以血清直接凝集效價(jià)≥1:160判定為合格待測(cè)血清,用于后續(xù)ELISA測(cè)定。 3.建立ELISA反應(yīng)模式:以LytA和CbpA為抗原,建立間接ELISA反應(yīng)模式,測(cè)定感染小鼠血清中相應(yīng)的IgG和IgM抗體,評(píng)價(jià)診斷價(jià)值。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a(+)-lytA和pET-32a(+)-cbpA,表達(dá)的重組蛋白LytA和CbpA具有較好的抗體結(jié)合活性。 2.成功建立細(xì)菌感染小鼠模型,確定感染血清標(biāo)本來(lái)源的可靠性。 3.實(shí)驗(yàn)組小鼠(肺炎鏈球菌感染組)IgM和IgG類抗LytA抗體滴度高于對(duì)照組(正常對(duì)照組和乙型鏈球菌感染對(duì)照組),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),CbpA抗體與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與乙型鏈球菌感染組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。CbpA蛋白對(duì)感染小鼠診斷的敏感性較高(IgG:83.3%;IgM:75%),而LytA特異性較高(IgG:100%;IgM: 100%)。 結(jié)論: 1.證實(shí)了機(jī)體受肺炎鏈球菌刺激后血清中會(huì)出現(xiàn)某些抗體,可以用作血清學(xué)診斷。 2.通過(guò)基因工程技術(shù)獲取的重組蛋白LytA和CbpA具有良好的抗體結(jié)合活性,可用于血清學(xué)反應(yīng)。 3.以重組蛋白LytA和CbpA為抗原建立的ELISA反應(yīng)模式可用于檢測(cè)血清中相應(yīng)的抗體,協(xié)同利用重組蛋白CbpA診斷敏感性及LytA的特異性,對(duì)肺炎鏈球菌感染小鼠的血清學(xué)診斷具有一定價(jià)值,為進(jìn)一步用于臨床診斷奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

S.P革蘭染色結(jié)果(×1000)

菌形態(tài)學(xué)檢查色和奧爾特法莢膜染色結(jié)果如圖 1-1、1-2 所示。長(zhǎng)的球菌，鈍端相對(duì)；奧爾特法莢膜染色觀察到在。圖 1-1 S.P 革蘭染色結(jié)果(×1000)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R563.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 景巍,王轉(zhuǎn)花;一種快速純化蛋白的電洗脫方法[J];生物技術(shù);2004年02期

，

本文編號(hào)：2668655