【摘要】：急性肺損傷(acute lung injury,ALI)為肺炎及嚴重膿毒癥等患者常見并發(fā)癥之一,其惡化階段即為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),預(yù)后差,病死率高,迄今尚無安全有效的早期干預(yù)藥物,亟待研究進一步解決。肺血管內(nèi)皮細胞是ALI中最為重要的效應(yīng)細胞受損靶細胞,也是ALI藥物干預(yù)的重要靶點。課題組前期構(gòu)建了肺血管內(nèi)皮細胞靶向的細胞間粘附分子-1(ICAM-1)單抗辛伐他汀納米脂質(zhì)載體(ICAM-NLC),具有一定早期ALI抗炎能力,但總體效果不甚理想,有待進一步提高。為此,本論文通過納米基因轉(zhuǎn)染技術(shù),以陽離子魚精蛋白(protamine,Pro)為 DNA 密接材料,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)基因為基因藥物,在前期制備ICAM-NLC納米載體的基礎(chǔ)上,通過靜電吸附法繼續(xù)構(gòu)建ICAM-1單抗辛伐他汀納米脂質(zhì)載體/魚精蛋白/Ang-1基因三元復(fù)合物(ICAM-NLC/Pro/Ang),即Ang-1基因與辛伐他汀納米共傳遞系統(tǒng),將Ang-1基因與辛伐他汀共同靶向輸送至ALI肺血管內(nèi)皮細胞,以期通過基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合用藥的方式,進一步提高ALI的早期干預(yù)能力。采用靜電吸附法構(gòu)建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物,形狀呈類球狀,粒徑隨ICAM-NLC質(zhì)量比例的增高而增大,當(dāng)ICAM-NLC/Pro/Ang質(zhì)量比例增加至30:4:1時,三元復(fù)合物粒徑達到最大約為351.7nm,Zeta電位為12.1mV。凝膠阻滯試驗表明,當(dāng)ICAM-NLC對DNA的比例在10到30之間時,三元復(fù)合物中的DNA均可以被完全阻滯,體現(xiàn)了所制備的三元復(fù)合物對Ang-1基因的良好保護作用。MTT法細胞毒性試驗結(jié)果顯示,三元復(fù)合物與EAhy926細胞共同孵育48h后,細胞存活率高達90%以上,表明三元復(fù)合物較低的細胞毒性,是潛在的ALI基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合用藥的納米載藥系統(tǒng)。以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞株EAhy926細胞24h,構(gòu)建ALI血管內(nèi)皮細胞模型。研究結(jié)果顯示,與正常EAhy926細胞相比,經(jīng)LPS活化后,流式細胞儀所檢測到的表達ICAM-1粘附分子的細胞比例從17.2%提高至50.0%,說明成功構(gòu)建ALI血管內(nèi)皮細胞模型。用標記了羅丹明(ROX)染料的DNA代替目的基因Ang-1,制備ROX標記的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元復(fù)合物,考察三元復(fù)合物在EAhy926細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。細胞攝取研究表明,隨著ICAM-NLC比例提高,三元復(fù)合物的細胞攝取程度降低,考慮與三元復(fù)合物的粒徑增大有關(guān);與非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組相比,經(jīng)ICAM-1單抗修飾的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA 三元復(fù) 合物細 胞轉(zhuǎn)運 能力明 顯提升,表明 ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元復(fù)合物對LPS活化后的EAhy926經(jīng)ICAM-1單抗介導(dǎo)的細胞靶向特性。制備ROX和異硫氰基熒光素(FITC)標記的ICAM-NLC/Pro/DNA三元復(fù)合物,考察三元復(fù)合物中基因(ROX標記)與NLC(FITC標記)的細胞攝取共定位,結(jié)果表明三元復(fù)合物與EAhy926細胞孵育6h后,NLC主要分布在細胞質(zhì)中,而DNA則部分轉(zhuǎn)運到細胞核,說明以NLC為基礎(chǔ)的納米給藥系統(tǒng)具有潛在的DNA核導(dǎo)入能力。以ICAM-1單抗阻斷細胞表面的ICAM-1粘附分子后,流式細胞儀定量檢測顯示,攝取ICAM-NLC/Pro/DNA(30:4:1,w/w/w)三元復(fù)合物的EAhy926細胞樣本MFIs從32降低到了 23,表明經(jīng)細胞粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)介導(dǎo)的內(nèi)吞機制是三元復(fù)合物細胞轉(zhuǎn)運的主要途徑之一。采用DiR熒光染料標記ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元復(fù)合物,以LPS誘導(dǎo)構(gòu)建ALI Balb/c小鼠模型,三元復(fù)合物尾靜脈注射給藥6h后,小鼠體內(nèi)分布顯示肺臟熒光強度最強,證實了 ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物的肺組織靶向特征。以綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒pEGFP為報告基因(EGFP)替代Ang-1基因,制備綠色熒光蛋白標記的ICAM-NLC/Pro/EGFP三元復(fù)合物,考察三元復(fù)合物在EAhy926模型細胞的基因轉(zhuǎn)染效率;研究結(jié)果顯示:三元復(fù)合物在EAhy926模型細胞內(nèi)均具有較強的綠色熒光蛋白表達能力(20%以上);隨著ICAM-NLC與DNA的重量比從10/1增加到30/1,三元復(fù)合物的細胞轉(zhuǎn)染效率呈輕微下降趨勢,這可能與NLC比例較高的三元復(fù)合物粒徑較大,從而更難被細胞攝取有關(guān);與非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組相比,ICAM-NLC/Pro/EGFP組的基因轉(zhuǎn)染效率顯著提高�？紤]到辛伐他汀給藥劑量及粒徑較大納米粒利于肺組織靶向的需要,選擇ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)作為后續(xù)Ang-1蛋白表達及動物藥效學(xué)研究。以Western Blot法測定三元復(fù)合物在ALI模型細胞及模型動物的Ang-1蛋白表達情況。結(jié)果顯示:與EAhy926細胞孵育48h后,ICAM-NLC/Pro/Ang組細胞內(nèi)Ang-1蛋白表達含量顯著高于靜息細胞組、LPS活化細胞組以及ICAM-NLC細胞組(P0.001);而ICAM-NLC/Pro/Ang組Ang-1蛋白表達又顯著高于非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組(P0.05),可能是基于ICAM-NLC/Pro/Ang對高表達ICAM-1 EAhy926細胞的靶向性。ALI模型小鼠給予ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物48h后,肺組織Ang-1蛋白的表達趨勢與EAhy926細胞的表達趨勢基本一致。表明ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元復(fù)合物具有提高ALI模型細胞以及模型小鼠中Ang-1蛋白表達水平的作用,具有潛在的改善ALI血管內(nèi)皮損傷的作用。選擇Balb/c小鼠,氣管滴注LPS構(gòu)建ALI小鼠模型,進行三元復(fù)合物對ALI小鼠模型保護作用的藥效學(xué)研究。研究發(fā)現(xiàn),ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)給藥24h、48h后,與ICAM-NLC組、非ICAM-1單抗修飾三元復(fù)合物組相比,具有顯著改善小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)等炎癥因子水平、炎癥細胞總計數(shù)以及多形核白細胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)占BALF中總細胞比例的作用,并且48h的炎癥因子水平及炎癥細胞水平與24h較為相似;HE染色組織病理切片也提示,ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)對ALI模型小鼠病理肺組織的炎癥細胞浸潤、肺泡隔增厚等病理表征均具有最顯著的改善作用。上述結(jié)果表明,本研究所構(gòu)建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元復(fù)合物,即Ang-1基因與辛伐他汀納米共傳遞系統(tǒng),可有效將Ang-1基因與辛伐他汀共同靶向輸送至ALI肺組織,通過基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合用藥的方式,可改善ALI早期的炎癥水平,進一步提高了 ALI的早期干預(yù)能力,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
【圖文】：

１．３結(jié)果與討論逡逑１．３．１邋ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元復(fù)合物的制備逡逑采用靜電吸附法制備ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元復(fù)合物。如圖１．１所示，帶陰離逡逑９逡逑

ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ａ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑１＿３．５邋ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ三元復(fù)合物細胞毒性評價逡逑采用ＭＴＴ法考察三元復(fù)合物的細胞毒性，結(jié)果見圖１．５。ＭＴＴ結(jié)果表明，逡逑ＥＡｈｙ９２６邋細胞與邋Ａｎｇ／Ｐｒｏ、ＩｇＧ－ＮＬＣ／Ｐｒｏ／Ａｎｇ、ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ邋共同孵育邋４８逡逑ｈ后，不同質(zhì)量比例的ＩｇＧ－ＮＬＣ／邋Ｐｒｏ／Ａｎｇ及ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ三元復(fù)合物細胞逡逑存活率均大于９０％；而孵育Ａｎｇ／ＰＥＩ２５Ｋ４８ｈ后，細胞存活率約６０％，細胞存活率逡逑較低，體現(xiàn)本研究中ＩＣＡＭ－ＮＬＣ／Ａｎｇ／Ｐｒｏ三元復(fù)合物納米載體對模型細胞具有較逡逑高的安全性，可作為潛在的ＡＬＩ基因治療與化學(xué)治療聯(lián)合的納米給藥系統(tǒng)載體。逡逑１４逡逑
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R563

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 石學(xué)慧;張素蘭;曹夏;王凌燕;段霞;劉未艾;張志萍;;巨刺對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1蛋白表達的影響[J];中國中醫(yī)急癥;2015年09期

2 張秋雁;朱偉;徐瑾瑜;唐金強;梁昊;蘇劍峰;唐映紅;逯晶;;丹龍醒腦方對腦缺血再灌注大鼠血管新生及對Ang-1蛋白表達的影響[J];中國實驗方劑學(xué)雜志;2016年01期

3 楊慧;侯麗淳;王復(fù)新;;大鼠腦出血周邊組織VEGF表達及Ang-1對其變化的影響[J];黑龍江醫(yī)藥科學(xué);2012年01期

4 尹育華;吳曉光;;補陽還五湯預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷沙鼠VEGF和Ang-1表達的影響[J];臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志;2012年07期

5 張小娟;方煒;黃叢洋;林愛武;戴慧莉;倪兆慧;錢家麒;;高糖和甲基乙二醛對血管周細胞增殖及Ang-1表達的影響[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年05期

6 吳遠華;朱廣旗;曹麗平;黃nr;邵勇;;通竅化栓湯對急性腦梗死患者血清中VEGF、Ang-1的影響[J];遼寧中醫(yī)雜志;2012年08期

7 張金康;孟國林;劉建;胡蘊玉;袁志;段春光;白峰;李丹;白建萍;劉民;;聯(lián)合轉(zhuǎn)染人VEGF_(165)和ANG-1雙基因?qū)Υ笫蠊撬杌|(zhì)干細胞成骨分化的影響[J];中國矯形外科雜志;2011年12期

8 陳樺;曾莉;;Ang-1治療大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變的實驗研究[J];南昌大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2010年02期

9 張秋雁;蘇劍峰;王權(quán)禮;鄧冰湘;蔡光先;李雅;;血府逐瘀湯對急性心肌缺血大鼠缺血心肌bFGF、Ang-1表達的影響[J];世界中西醫(yī)結(jié)合雜志;2010年11期

10 朱成楚;陳仕林;劉玉清;唐禮江;包衛(wèi)光;;ANG-1基因重組腺相關(guān)病毒獲取及轉(zhuǎn)染豬骨髓干細胞的研究[J];浙江大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 潘秀花;楊占山;岳凌;潘鵬;;VEGF和Ang-1在皮膚創(chuàng)傷和放射性燒傷愈合過程中表達變化的研究[A];21世紀初輻射防護論壇第五次會議論文集[C];2006年

2 王瀟;周青;陳茜;陳金玲;郭瑞強;;攜抗ICAM-1靶向微泡定向轉(zhuǎn)染Ang-1基因治療急性心肌梗死[A];第十屆全國超聲心動圖學(xué)術(shù)會議論文[C];2010年

3 范金柱;張金康;陳實;孟國林;楊柳;劉建;;腺病毒介導(dǎo)人VEGF165和ANG-1雙基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞及對其增殖的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會第六次全國骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病分會成立十周年論文匯編[C];2011年

4 陳治;鄭興學(xué);王偉;黃宗海;;燒傷血清對血管內(nèi)皮細胞VEGF及Ang-1表達的影響[A];第四屆全國燒傷救治專題研討會燒傷感染救治新進展論文匯編[C];2006年

5 王瀟;周青;陳茜;陳金玲;郭瑞強;;攜抗ICAM-1靶向微泡定向轉(zhuǎn)染Ang-1基因治療急性心肌梗死[A];中國超聲醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第十一屆全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2012年

6 吳遠華;朱廣旗;曹麗平;黃nr;邵勇;;通竅化栓湯對急性腦梗死患者血清中VEGF、Ang-1的影響[A];貴州省第六屆中西醫(yī)結(jié)合神經(jīng)科學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2013年

7 陳柏齡;張志堅;黃東煜;吳秀麗;王偉;;慢病毒載體介導(dǎo)Ang-1基因修飾的骨髓間質(zhì)干細胞移植治療腦梗死[A];第九次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會論文匯編[C];2006年

8 劉紹能;時磊;李敏;呂鑫霞;闞杰;馬繼征;陳蘭羽;;芪術(shù)顆粒對Ang-1、Ang-2/Tie-2動態(tài)變化的影響[A];第二十二屆全國中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)會議暨消化疾病診治進展學(xué)習(xí)班論文匯編[C];2010年

9 王瀟;陳茜;周青;陳金玲;郭瑞強;;SonoVue微泡介導(dǎo)轉(zhuǎn)染Ang-1基因治療急性心肌梗死[A];中華醫(yī)學(xué)會第十次全國超聲醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2009年

10 呂海濤;謝宇鋒;楊向軍;孫凌;楊吉成;韓蓮花;李紅霞;盛偉華;朱伯會;;Ang-1基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染兔外周血血管內(nèi)皮祖細胞的實驗研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國兒科學(xué)術(shù)大會論文匯編（上冊）[C];2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 姜賽平;Ang-1基因與辛伐他汀納米共傳遞系統(tǒng)對脂多糖誘導(dǎo)急性肺損傷小鼠保護作用研究[D];浙江大學(xué);2019年

2 汪迎暉;ICAM-1靶向載Ang-1基因微泡的制備及瞬時轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮細胞的研究[D];武漢大學(xué);2012年

3 陳浩;Ang-1在多發(fā)性骨髓瘤中的表達和青蒿琥酯、β-欖香烯抗骨髓瘤效應(yīng)[D];河北醫(yī)科大學(xué);2010年

4 張素勤;電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織Ang-1、COX-2表達影響的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2012年

5 劉登輝;ANG-1在AS髖關(guān)節(jié)韌帶中表達增加并通過Notch信號通路調(diào)節(jié)血管再生[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2017年

6 郭鵬;Notch、VEGF-A、Ang-1信號通路在非血管化輸送盤牽張成骨中調(diào)控血管新生的機制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 龐斯斯;HGF、PDGF、VEGF和Ang-1在ACS患者冠脈局部的作用以及機制初步探討[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

8 王蕾;補腎活血中藥對慢性腦缺血認知障礙大鼠血管新生、神經(jīng)保護機制的實驗研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2014年

9 段春光;雙基因修飾促進組織工程化人工骨血管化的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 潘秀花;VEGF和Ang-1在皮膚創(chuàng)傷和放射性燒傷愈合過程中表達變化的研究[D];蘇州大學(xué);2006年

2 張素蘭;巨刺對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織VEGF和Ang-1表達的影響[D];湖南中醫(yī)藥大學(xué);2016年

3 徐國華;VEGF、Ang-1與支氣管哮喘氣道重塑的關(guān)系[D];山西醫(yī)科大學(xué);2008年

4 袁杰;法舒地爾對大鼠局灶性腦缺血再灌注后VEGF、Ang-1及Ⅷ因子表達的影響[D];中南大學(xué);2009年

5 馬倩倩;攜帶Ang-1基因的骨髓間充質(zhì)干細胞對早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變模型小鼠的干預(yù)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2014年

6 侯曉芬;妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中Ang-1和VEGF的表達及意義[D];山西醫(yī)科大學(xué);2011年

7 蔣曉萌;Ang-1、VEGF在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達[D];石河子大學(xué);2010年

8 沈國友;電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)VEGF及Ang-1的影響[D];湖北中醫(yī)學(xué)院;2009年

9 陳樺;ANG-1對大鼠糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管形成的影響[D];南昌大學(xué);2010年

10 劉鐵連;Ang-1或/和VEGF165轉(zhuǎn)基因細胞修飾的再生絲素膜誘導(dǎo)血管形成效應(yīng)及分子機制研究[D];蘇州大學(xué);2009年

，

本文編號：2661006