【摘要】： 哮喘是一種以氣道高反應(yīng)性,氣道炎癥和氣道重建為特征的慢性疾病,目前患病率顯著性增高[1],并且被認(rèn)為是喪失勞動能力、醫(yī)療消費(fèi)和可預(yù)防性死亡的主要原因之一[2]。到目前為止許多研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)證實:在慢性哮喘,氣道平滑肌在誘導(dǎo)氣道重建中起著主要作用[3-6]。氣道平滑肌細(xì)胞的反常增殖導(dǎo)致了氣道重建和氣道高反應(yīng)性,但是其具體的機(jī)制目前還不很清楚。 蛋白激酶C(PKC)是一絲氨酸-蘇氨酸激酶家族,它包括三種類型的異構(gòu)體。傳統(tǒng)型(α, ?1, ?2,和γ)可被鈣、佛波酯和磷脂酰絲氨酸所激活;新型(δ,ε,η,θ, andμ)對鈣不敏感,但可被佛波酯和磷脂酰絲氨酸所激活;不典型型(ζandτ/λ)對鈣和佛波酯不敏感,但可被磷脂酰絲氨酸激活。人氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)PKCα, ?1, ?2,δ,ε, andζ[7]。不同的異構(gòu)體的體外激酶活性特征以及組織分布、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)是有差別的。這些異構(gòu)體參與信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡、遷徙和粘附[8-10]。許多研究者已經(jīng)證明:PKC的激活是ASMCs增殖的必需事件[11-15],并且,不同的PKC異構(gòu)體在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖中起著不同的作用。在NIH3T3細(xì)胞,PKCε是一強(qiáng)有力的生長刺激因素,而PKCα和δ抑制生長[16]。在A7r5血管平滑肌細(xì)胞[17],毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞[18]和鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞[19],PKCδ也抑制細(xì)胞周期進(jìn)展。在血管平滑肌細(xì)胞,PKCδ的過度表達(dá)抑制G1期周期蛋白的表達(dá)[17],這與PKCδ控制周期蛋白D1的轉(zhuǎn)錄的假設(shè)一致。在人,牛和鼠氣道平滑肌細(xì)胞,PKCδ負(fù)性調(diào)節(jié)cyclinD1的轉(zhuǎn)錄[20]。我們實驗室已經(jīng)證實:PKCα參與哮喘血清被動致敏的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖[21]。 然而,PKCα調(diào)節(jié)的下游機(jī)制目前還不清楚。細(xì)胞周期進(jìn)展是細(xì)胞增殖的的基本事件,目前已經(jīng)有一些關(guān)于ASMCs中調(diào)節(jié)特殊細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究[22]。cyclinD(D1,D2和D3)是哺乳動物細(xì)胞G1期進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白,cyclinD1是許多生長刺激信號通路的靶基因[23,24]。 那么,在哮喘人氣道平滑肌細(xì)胞,cyclinD1是否起關(guān)鍵作用?PKCα是否可通過調(diào)節(jié)cyclinD1表達(dá)來影響ASMC增殖?為此,我們利用哮喘血清被動致敏的細(xì)胞模型來研究這些問題。 研究內(nèi)容 1.用10%哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs)(B組),以10%非哮喘者血清為對照(A組)。構(gòu)建cyclinD1正、反義真核表達(dá)載體質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染干預(yù)HASMC。用RT-PCR方法以及Western Blot方法檢測cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平,用流式細(xì)胞術(shù)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)法及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測HASMC增殖。 2.生長融合、同步后的HASMCs用哮喘血清致敏后,分為對照組,PMA組和PMA+Go6976組。干預(yù)24小時后,用3H-TdR摻入法和MTT法檢測細(xì)胞增殖;用碘化丙啶單染法流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期;用RT-PCR和western blotting檢測cyclinD1mRNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步,我們還通過轉(zhuǎn)染重組的反義cyclinD1質(zhì)粒(PCDNA3.1(+)/as-cyclinD1)來降低cyclinD1基因的表達(dá)后,檢測PKCα對HASMCs增殖的影響。 3.用10%哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs),予以PKC激活劑PMA刺激。分別以反義寡核苷酸(PKCα-asODN)和特異性阻斷劑U0126抑制PKCα和ERK的表達(dá),用RT-PCR方法及Western Blot方法檢測干預(yù)前后cyclinD1和P21cip1的mRNA及蛋白表達(dá)水平,用流式細(xì)胞術(shù)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HASMCs增殖。 4.用10%哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs),予以PKC激活劑PMA刺激。分別以反義寡核苷酸(PKCα-asODN)和PDTC抑制PKCα表達(dá)和NF-κB活化。用凝膠電泳遷移率改變試驗(EMSA)檢測HASMCs中NF-κB的活性,用RT-PCR方法及Western Blot方法檢測干預(yù)前后cyclinD1的mRNA及蛋白表達(dá)水平,用流式細(xì)胞術(shù)和四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測HASMCs增殖。 結(jié)果 1.正常血清對照組細(xì)胞S期細(xì)胞比例、MTT吸光度值(A值)、PCNA表達(dá)陽率分別為(10.52±1.50)%、0.303±0.024和(39.4±8.53)%;哮喘血清組(B0組)細(xì)胞S期細(xì)胞比例、MTT吸光度值(A值)、PCNA表達(dá)陽率分別為(15.94±2.13)%、0.431±0.047和(53.2±7.5)%,均較對照血清組(A組)明顯增加(n=5,P0.05);轉(zhuǎn)染重組cyclinD1正義質(zhì)粒組(B2組)細(xì)胞S期細(xì)胞比例、MTT吸光度值(A值)、PCNA表達(dá)陽性分別為(26.10±2.16)%、0.591±0.042和(84.2±5.9)%,均較哮喘血清組(B0組)明顯增加(n=5,P0.05);而轉(zhuǎn)染反義質(zhì)粒組(B3組)上述結(jié)果分別為(6.96±1.25)%、0.220±0.027和(29.8±8.2)%,均較哮喘血清組(B0組)明顯下降(n=5,P0.05)。 2. PMA激活PKCα后上調(diào)cyclinD1表達(dá)和細(xì)胞增殖。而用Go6976特異性抑制PKCα活性后,這種促cyclinD1表達(dá)和細(xì)胞增殖的作用顯著性下降。相反, PMA和Go6976對周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)的表達(dá)無明顯影響。另外,轉(zhuǎn)染反義cyclinD1質(zhì)粒后消除了PMA誘導(dǎo)的G1/S期進(jìn)展和HASMCs增殖效應(yīng)。 3. PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高,ERK1/2,p-ERK1/2蛋白水平增高,cyclin D1、P21cip1表達(dá)明顯增強(qiáng), HASMCs的增殖增強(qiáng);而反義PKCα寡核苷酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞抑制p-PKCα表達(dá)后,ERK1/2,p-ERK1/2表達(dá)明顯減弱,cyclin D1、P21cip1表達(dá)也明顯下降,HASMCs的增殖減弱(P0.05,n=4).;用U0126抑制ERK1/2表達(dá)后,PMA刺激下p-PKCα水平仍然明顯增高,但cyclin D1、P21cip1的表達(dá)明顯下降,HASMCs的增殖減弱(P0.05,n=4).。 4. PMA刺激后磷酸化PKCα(p-PKCα)水平增高,NF-κB-DNA結(jié)合活性增強(qiáng),cyclin D1表達(dá)明顯增強(qiáng), HASMCs的增殖增強(qiáng);而反義PKCα寡核苷酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞特異性地抑制PΚCα表達(dá)后,p-PKCα水平下降,NF-κB-DNA結(jié)合活性明顯減弱,cyclin D1也明顯下降,HASMCs的增殖減弱(P0.05,n=4);用PDTC抑制NF-κB活性后,PMA刺激下p-PΚCα水平仍然明顯增高,但cyclin D1的表達(dá)明顯下降,HASMCs的增殖減弱(P0.05,n=4)。 結(jié)論 1. cyclinD1促進(jìn)哮喘血清被動致敏的HASMC的增殖。cyclinD1可能是哮喘HASMC增殖的重要調(diào)控蛋白。 2. PKCα可通過上調(diào)cyclinD1表達(dá)而促進(jìn)哮喘血清被動致敏的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖。 3. ERK1/2是PKCα的下游信號分子,PKCα-ERK1/2級聯(lián)參與了PMA所誘導(dǎo)的哮喘血清被動致敏的人氣道平滑細(xì)胞cyclin D1、P21cip1的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞增殖。 4. NF-κB是PKCα的下游信號分子,PΚCα- NF-κB級聯(lián)參與了PMA所誘導(dǎo)的哮喘血清被動致敏的人氣道平滑細(xì)胞cyclin D1的表達(dá)上調(diào)及細(xì)胞增殖。 綜上所述,上述結(jié)果表明:PKCα、cyclinD1參與了哮喘HASMC的增殖調(diào)控,并存在PKCα-ERK1/2-cyclinD1、PΚCα-NF-κB-cyclinD1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,從不同環(huán)節(jié)阻斷這一信號途徑對于針對性地抑制哮喘氣道平滑肌增殖、減輕氣道重建可能具有積極意義。這為研究哮喘氣道重建的發(fā)病機(jī)理提供新的理論,也為將來治療難治性哮喘提供一定的新思路。
【圖文】：

HASMC呈現(xiàn)“峰和谷”生長狀態(tài)

HASMCα-actin免疫熒光表達(dá)陽性
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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1 許淑云,徐永健,張珍祥,倪望,陳士新;核因子KB在被動致敏的人氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[J];中華內(nèi)科雜志;2004年12期

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本文編號：2652465