發(fā)布時間：2020-05-06 17:38

【摘要】：特發(fā)性肺纖維化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種以進行性呼吸困難、運動耐力下降、肺實質(zhì)的間質(zhì)性浸潤及肺限制性肺通氣功能障礙為主要特征的慢性進展性纖維化性間質(zhì)性肺炎,呼吸衰竭是IPF患者死亡的根本原因,確診后的平均中位生存期3-5年,目前除了肺移植以外尚無任何有效的治療方法。該病主要是老年人的疾病,好發(fā)于成年男性,確診時年齡多為65歲以上。目前已有證據(jù)表明,IPF和衰老之間存在相關(guān)性,是一種多種原因及途徑共同作用的衰老相關(guān)性疾病,端粒酶及DNA甲基化均作為細胞衰老相關(guān)因素,參與了IPF的發(fā)生發(fā)展。IPF病情的發(fā)生發(fā)展中,TGF-β可以導(dǎo)致端粒酶異常,而DNA甲基化可能參與其中。TGF-β和端粒酶作為重要的分子共同參與了IPF的進程,可能使細胞不斷發(fā)生細胞復(fù)制性衰老的惡性循環(huán)。研究表明TERT和DNMT3a、DNMT3b分別被認為是端粒酶活性及DNA甲基化的關(guān)鍵限速因子,可以分別作為反映端粒酶活性及DNA甲基化水平的指標(biāo)對端粒酶和DNA甲基化進行研究。那么在IPF中TGF-β1是否可以導(dǎo)致端粒酶活性及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶發(fā)生改變?如何發(fā)生變化?有無相關(guān)干預(yù)措施?本課題以IPF中TGF-β1引起端粒酶活性與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的變化及兩者的相互關(guān)系為研究切入點,探討其在IPF發(fā)病中的作用及干預(yù)措施。首先研究IPF患者和正常人群外周血中TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表達情況,證實IPF患者和正常人群中TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表達存在差異;之后在動物實驗中進一步研究年齡因素對肺纖維化小鼠TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表達的影響,證實上述指標(biāo)的變化及動物模型病變程度與年齡因素相關(guān);最后進行細胞實驗驗證,研究TGF-β1誘導(dǎo)的A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT及DNMT3a、DNMT3b的表達異常、相互作用及干預(yù)措施。證實TGF-β1通過DNA甲基化調(diào)控TERT表達并提出相關(guān)干預(yù)措施。共分為三個部分,六個實驗。第一部分IPF患者外周血TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表達研究實驗一IPF患者外周血TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表達研究目的:研究IPF患者中外周血白細胞TERT及外周血血清中DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1的表達情況。方法:選擇不合并有其他疾病的年齡"g60歲男性IPF患者10名為IPF組,選擇沒有基礎(chǔ)疾病的年齡"g60歲男性10名為對照組,收集臨床基本數(shù)據(jù),ELISA檢測對照組及IPF組血清TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b蛋白表達的影響;Western Blot法檢測對照組及IPF組外周血白細胞TERT蛋白表達的影響。結(jié)果:1.IPF組血清TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b蛋白的表達與對照組相應(yīng)指標(biāo)比較均表達升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。IPF組血清IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b的表達與TGF-β1的表達均呈正相關(guān)。2.實驗組外周血白細胞TERT蛋白相對表達量與對照組相比表達升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:IPF患者外周血血清中TGF-β1、IL-1β、IL-6及DNMT3a、DNMT3b的含量及外周血白細胞TERT的含量均高于正常對照組健康人群。第二部分年齡因素對小鼠肺纖維化模型TERT、DNMT3a、DNMT3b及TGF-β1表達影響的研究實驗二年齡因素對小鼠肺纖維化模型中TERT及TGF-β1表達影響的研究目的:研究小鼠肺纖維化過程中年齡因素對TERT活性變化的影響,探討TGF-β1、IL-1β及IL-6在IPF過程中的變化規(guī)律及意義。方法:128只10-12周齡雄性C57BL/6小鼠,無特殊病原體SPF級,飼養(yǎng)至20周齡時,隨機分為青年肺纖維化模型組(A組),青年正常對照組(B組),老年肺纖維化模型組(C組),老年正常對照組(D組),每組32只。A組小鼠氣管內(nèi)注入博萊霉素(5mg/kg)制造肺纖維化模型;B組氣管內(nèi)注入同等劑量生理鹽水進行對照,C組和D組飼養(yǎng)至26周齡后分別對應(yīng)使用A組和B組的造模方法制造老年肺纖維化組模型和老年正常對照組模型。造模后的第7、14、21、28天分別在A組、B組、C組和D組中每組隨機抽取8只小鼠,用腹主動脈采血法處死后,留取肺組織標(biāo)本及血液標(biāo)本待測。小鼠肺組織HE染色及Ashcroft評分評定肺纖維化程度;Masson染色觀察小鼠肺組織膠原分布;小鼠肺組織E-Cad、Vimentin、α-SMA免疫組化及灰度值檢測;ELISA法檢測小鼠血漿中TGF-β1、IL-1β、IL-6蛋白的含量;Western Blot法檢測小鼠肺組織TERT蛋白含量。結(jié)果:1.向小鼠氣管注入BLM(5mg/kg)制造小鼠肺纖維化模型造模成功。與青年肺纖維化小鼠相比,老年肺纖維化模型組小鼠纖維化程度更加嚴重,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.與對照組小鼠相比,模型組小鼠E-Cad表達降低,α-SMA及Vimentin表達增高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,三者隨病程進展而變化明顯,三者各自差異在對照組28天、模型組14天、模型組28天較為顯著;與青年模型組小鼠相比,老年模型組小鼠各相同造模時間點E-Cad陽性率低,α-SMA及Vimentin陽性率高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.A組與C組血清中TGF-β1、IL-1β及IL-6含量高于B組和D組,三者在A組與B組、C組與D組同一時間點兩兩比較P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;但在A組與C組、B組與D組同一時間點兩兩比較P0.05,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義。4.與對應(yīng)時間點B組與D組相比,A組與C組第7天、第14天、第21天和第28天肺組織TERT蛋白相對表達量升高,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與各自第7天、第21天和第28天表達量相比,A組與C組第14天肺組織TERT蛋白相對表達量升高,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。5.與對應(yīng)時間點B組和A組相比,D組和C組第14天和第28天肺組織TERT蛋白相對表達量升高,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。B組第14天肺組織TERT蛋白相對表達量與其第28天相比表達升高,D組第14天肺組織TERT蛋白相對表達量與其第28天相比表達升高,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。6.A組第14天肺組織TERT蛋白相對表達量、A組第28天肺組織TERT蛋白相對表達量、B組第14天或28天肺組織TERT蛋白相對表達量之間三者兩兩比較,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;C組第14天肺組織TERT蛋白相對表達量、C組第28天肺組織TERT蛋白相對表達量、D組第14天或28天肺組織TERT蛋白相對表達量之間三者兩兩比較,P0.05,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。7.C組和A組肺組織TERT蛋白相對表達量均在第14天達到高峰,第28天明顯下降。但與A組相比,C組TERT蛋白相對表達量變化波動大。結(jié)論:1.小鼠肺纖維化過程中,肺組織E-Cad含量減少,α-SMA及Vimentin含量升高;老年小鼠肺纖維化程度更嚴重;肺纖維化小鼠血清中TGF-β1、IL-1β及IL-6含量明顯升高,TGF-β1、IL-1β及IL-6參與了肺纖維化的發(fā)生發(fā)展。2.肺纖維化小鼠肺組織TERT的活性變化是先升高再降低,老年肺纖維化小鼠肺組織TERT變化波動程度大,年齡因素可能通過影響小鼠肺纖維化模型中肺組織TERT的活性來改變小鼠肺纖維化病變程度。實驗三年齡因素對小鼠肺纖維化模型中DNMT3a、DNMT3b及CDH1表達影響的研究目的:研究小鼠肺纖維化過程中年齡因素對DNMT3a、DNMT3b及CDH1表達的影響。方法:32只10-12周齡雄性C57BL/6小鼠,無特殊病原體SPF級,飼養(yǎng)至20周齡時,隨機分為青年肺纖維化模型組(A組),青年正常對照組(B組),老年肺纖維化模型組(C組),老年正常對照組(D組),每組8只,A組小鼠氣管內(nèi)注入博萊霉素稀釋液制造肺纖維化模型;B組氣管內(nèi)注入同等劑量生理鹽水進行對照,C組和D組飼養(yǎng)至26周齡后分別對應(yīng)使用A組和B組的造模方法制造老年肺纖維化組模型和老年正常對照組模型。麻醉和造模方法與實驗二中小鼠麻醉和造模方法相同;C組和D組飼養(yǎng)至26周齡后分別對應(yīng)使用A組和B組的造模方法制造老年肺纖維化組模型和老年正常對照組模型。A組、B組、C組和D組每組小鼠于造模后的第28天分別采用腹主動脈采血法處死,留取肺組織標(biāo)本待測。小鼠肺組織HE染色及Ashcroft評分評定肺纖維化程度;小鼠肺組織Masson染色觀察膠原分布;Western Blot法檢測小鼠肺組織DNMT3a、DNMT3b和CDH1的蛋白含量。結(jié)果:1.與B組相比,A組DNMT3a、DNMT3b蛋白表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與D組相比,C組DNMT3a、DNMT3b蛋白表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與A組相比,C組DNMT3a、DNMT3b蛋白表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與B組相比,D組DNMT3a、DNMT3b蛋白表達無明顯變化,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。2.與B組相比,A組CDH1蛋白表達明顯降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與D組相比,C組CDH1蛋白表達明顯降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與A組相比,C組CDH1蛋白表達明顯降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與B組相比,D組CDH1蛋白表達無明顯變化,P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:肺纖維化小鼠肺組織DNMT3a、DNMT3b的表達升高,CDH1表達降低,老年肺纖維化小鼠較青年肺纖維化小鼠更明顯。年齡因素可能通過影響小鼠肺纖維化模型中肺組織DNMT3a、DNMT3b及CDH1的表達來改變肺纖維化病變程度。第三部分TGF-β1誘導(dǎo)的A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT及DNMT3a、DNMT3b的表達異常及干預(yù)措施的研究實驗四TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1、TERT表達影響的研究目的:研究TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1、TERT及IL-1β和IL-6表達的影響。方法:培養(yǎng)A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞,分為對照組、TGF-β1 2μmol/L干預(yù)組、TGF-β1 5μmol/L干預(yù)組和TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組。β-gal染色法檢測TGF-β1梯度刺激對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞衰老的影響;ELISA檢測TGF-β1梯度刺激對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-1β、IL-6蛋白表達;Quantitative Real-time PCR檢測TGF-β1梯度刺激對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-1β、IL-6 m RNA的表達;觀察TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞細胞形態(tài)和膠原蛋白表達的影響;Quantitative Real-time PCR檢測TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA的表達;Quantitative Real-time PCR檢測TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a、DNMT3b、CDH1及TERT m RNA的表達;Western Blot法檢測TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT蛋白表達的影響。結(jié)果:1.正常對照組幾乎未出現(xiàn)衰老細胞,干預(yù)組細胞衰老百分比隨TGF-β1濃度升高而升高。2.TGF-β1 2μmol/L干預(yù)組、TGF-β1 5μmol/L干預(yù)組及TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-1β和IL6蛋白及m RNA的表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;兩者隨著TGF-β1濃度的升高,表達也進一步升高,TGF-β1 5μmol/L干預(yù)組、TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與TGF-β1 2μmol/L干預(yù)組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-1β和IL6蛋白及m RNA的表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;但TGF-β1 5μmol/L干預(yù)組與TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組作用相當(dāng),P0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.光鏡下觀察對照組細胞形態(tài)呈典型的上皮細胞樣形態(tài),TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組細胞出現(xiàn)典型的間質(zhì)細胞樣形態(tài),Masson染色后光鏡下觀察對照組細胞幾乎未見藍色膠原蛋白表達,而TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組細胞藍染膠原蛋白表達明顯增多,表達范圍明顯增加。4.TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a和DNMT3b m RNA的表達明顯升高,TERT和CHD1基因m RNA的表達明顯降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT蛋白表達明顯降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1.TGF-β1可導(dǎo)致A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生衰老,促進A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞IL-1β、IL6、COL-I、FN1和Tensin-C的表達。2.TGF-β1促進了A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a和DNMT3b的表達,抑制TERT和CHD1的表達。實驗五TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT啟動子活性及DNMT3a、DNMT3b轉(zhuǎn)錄因子與TERT啟動子結(jié)合影響的研究目的:研究TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT啟動子活性及DNMT3a、DNMT3b轉(zhuǎn)錄因子與TERT啟動子結(jié)合的影響。方法:培養(yǎng)A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞,分為對照組、TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組。熒光素酶法檢測TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT啟動子活性的影響;染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a和DNMT3b與TERT啟動子結(jié)合的影響。結(jié)果:1.TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT啟動子活性下降,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2.TGF-β1 10μmol/L干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a和DNMT3b轉(zhuǎn)錄因子與TERT啟動子的相對結(jié)合量增大,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。進一步比較DNMT3a和DNMT3b轉(zhuǎn)錄因子的富集情況,DNMT3a轉(zhuǎn)錄因子的富集比DNMT3b轉(zhuǎn)錄因子的富集多,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:TGF-β1促進了DNMT3a,DNMT3b轉(zhuǎn)錄因子與TERT啟動子的結(jié)合,DNMT3a轉(zhuǎn)錄因子與TERT啟動子的結(jié)合起較大作用。對TERT啟動子甲基化水平產(chǎn)生一定影響,進而使TERT啟動子活性下降。實驗六DNMT3a si RNA干擾與TERT過表達對TGF-β1誘導(dǎo)的A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞纖維化及衰老干預(yù)作用的研究目的:研究DNMT3a si RNA干擾與TERT過表達對TGF-β1誘導(dǎo)的A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞纖維化及衰老的干預(yù)作用。方法:培養(yǎng)A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞,分為對照組、TGF-β1干預(yù)組、TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾組、TGF-β1干預(yù)+TERT過表達組及TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾+TERT過表達組,對DNMT3a行si RNA干擾;選擇慢病毒為載體,進行質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染對TERT進行過表達處理,TGF-β1干預(yù)+TERT過表達組與TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾+TERT過表達組為質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染,對照組、TGF-β1干預(yù)組與TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾組行LV-GFP質(zhì)粒慢病毒空載對照。共聚焦激光掃描熒光顯微鏡檢測各組A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞熒光;Masson染色檢測各組A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞膠原蛋白的表達;Quantitative Real-time PCR檢測各組A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表達的影響;Western Blot法檢測各組A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞TERT、DNMT3a、DNMT3b和CDH1蛋白表達的影響;β-gal染色法檢測各組A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞的衰老情況。結(jié)果:1.DNMT3a si RNA干擾和TERT過表達成功。2.Masson染色后對照組細胞幾乎未見藍色膠原蛋白表達,而TGF-β1干預(yù)組細胞出現(xiàn)大量藍染膠原蛋白,其表達量及表達范圍均明顯增加,與對照組相比,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾組、TGF-β1干預(yù)+TERT過表達組與TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾+TERT過表達組均有藍染膠原蛋白表達,三組表達無差別,三組分別與對照組相比,藍染膠原蛋白表達量及表達范圍增加,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;三組分別與TGF-β1干預(yù)組相比,藍染膠原蛋白表達量及表達范圍均較減少,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3.TGF-β1干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞COL-I,FN1,Tensin-C m RNA表達明顯升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾組、TGF-β1干預(yù)+TERT過表達組與TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾+TERT過表達組三組的A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表達升高,三組分別與對照組相比,COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表達升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;三組分別與TGF-β1干預(yù)組相比,COL-I、FN1、Tensin-C m RNA表達降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。4.TGF-β1干預(yù)組與對照組相比,A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a、DNMT3b蛋白表達明顯升高,TERT、CDH1蛋白表達明顯降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾組、TGF-β1干預(yù)+TERT過表達組與TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾+TERT過表達組三組的A549人肺泡Ⅱ型上皮細DNMT3a、DNMT3b蛋白表達升高,TERT、CDH1蛋白表達降低,三組表達無差別;但分別與TGF-β1干預(yù)組相比,三組的A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞DNMT3a、DNMT3b蛋白表達降低,TERT、CDH1蛋白表達升高,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5.對照組幾乎未出現(xiàn)衰老細胞,而TGF-β1干預(yù)組出現(xiàn)大量衰老細胞,且衰老細胞的比例最大,而TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾組、TGF-β1干預(yù)+TERT過表達組與TGF-β1干預(yù)+DNMT3a si RNA干擾+TERT過表達組這三組均有衰老細胞表達,衰老細胞的比例三組表達無差別,但三組分別與對照組相比,衰老細胞增多及比例增大,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;三組分別與TGF-β1干預(yù)組相比,衰老細胞減少及比例降低,P0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:干擾DNMT3a si RNA與過表達TERT均可以減輕TGF-β1對A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞致纖維化作用和A549人肺泡Ⅱ型上皮細胞發(fā)生衰老的程度。但DNMT3a si RNA干擾與TERT過表達之間沒有疊加作用。
【圖文】：

TGF-β1標(biāo)準曲線

IL-1β標(biāo)準曲線
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R563
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本文編號：2651623