【摘要】： 培養(yǎng)的哮喘豚鼠氣道平滑肌細胞ryanodine受體內(nèi)鈣釋放功能的改變及其mRNA表達的變化 前言 哮喘是一種世界范圍內(nèi)嚴重危害人類健康的慢性炎癥性疾病。其發(fā)病機理相當復雜，諸多因素參與其中。近年來，人們逐漸認識到氣道平滑肌細胞(airwaysmooth muscle cells ASMCs)在介導哮喘的發(fā)病機制中起到了重要作用，而鈣離子作為細胞內(nèi)重要的第二信使參與調(diào)節(jié)了ASMCs的許多重要功能。細胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca~(2+)]i)升高在介導哮喘的氣道高反應性，氣道重構以及氣道炎癥中起到了非常關鍵的作用。細胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要通過外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放兩種途徑實現(xiàn)。目前，對外鈣內(nèi)流與哮喘關系的研究較為深入，臨床上已有應用鈣拮抗劑，通過抑制ASMCs的外鈣內(nèi)流治療哮喘。而對內(nèi)鈣釋放的研究相對較少。ASMCs中存在三磷酸肌醇受體(IP3R)和ayanodine受體／鈣通道(RyRs)兩種內(nèi)鈣釋放通道。有研究發(fā)現(xiàn)，IP3R和ayRs參與乙酰膽堿誘導引起的平滑肌細胞內(nèi)重復持續(xù)的鈣濃度改變。這種改變不能由IP3單獨啟動且不能被IP3R抑制劑完全抑制，但可被RyRs抑制劑完全抑制。本研究正是基于此點，制備卵蛋白誘導的哮喘豚鼠模型，分離培養(yǎng)其ASMCs，通過測定ASMCs內(nèi)鈣離子濃度的改變，并從分子水平研究ASMCs中RyRs各亞型mRNA的表達情況，比較正常和支氣管哮喘時的差異，以此提供哮喘發(fā)病的理論依據(jù)，也為開發(fā)治療哮喘的藥物提供新的作用靶點。同時，嘗試傳代培養(yǎng)哮喘豚鼠ASMCs，比較傳代與原代培養(yǎng)的ASMCs中RyRs內(nèi)鈣釋放通道的改變，探索獲得具有“哮喘”特性ASMCs的方法。 實驗材料和方法 1、材料 膠原酶(日本制藥株式會社)，雞卵清白蛋白(美國Sigma公司)，ryanodine(美國Sigma公司)，組織胺(histamine)(上海生化研究所)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(天津市生化制品廠)，F(xiàn)lou-3／AM，EGTA和HEPES(美國Sigma公司)，平滑肌特異α-肌動蛋白抗體(武漢博士德生物工程公司)，F(xiàn)ITC(中國醫(yī)科大學免疫教研室贈)。RT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)。Trizol reagent(美國Gibco公司)。 健康雄性豚鼠，體重0.3～0.4Kg。中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。 2、方法 豚鼠哮喘模型的制備：健康雄性豚鼠，體重0.3～0.4Kg。中國醫(yī)科大學實驗動物部提供。將豚鼠隨機分成空白對照組和哮喘組。哮喘組豚鼠腹腔注射10％卵蛋白生理鹽水溶液1mL，于第14天開始隔天超聲霧化吸入1％卵蛋白，每次2min，激發(fā)7次，觀察動物狀態(tài)。動物逐漸出現(xiàn)呼吸加快，最后出現(xiàn)腹式呼吸，提示造模成功。對照組采用生理鹽水霧化吸入，液體容積與哮喘組相同。 豚鼠ASMCs的分離培養(yǎng)：單只豚鼠擊頭處死，無菌取其全部主氣管。冰浴條件下，分離其外周結締組織及脂肪組織，剪開其軟骨面，用棉簽輕輕刮除氣管粘膜及粘膜下層后，分離兩側的軟骨，將分離的平滑肌束切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，以0.2％膠原酶37℃、通氣(95％O2和5％CO2)的條件下，消化2次，每次40 min，而后沖洗、穩(wěn)定、吹打、過濾離心后將細胞接種于培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶中，以含20％胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，取培養(yǎng)的第5-7天細胞用于測鈣，待細胞培養(yǎng)至80％融合進行收集，用于RT-PCR實驗。 豚鼠ASMCs的鑒定：肌動蛋白熒光抗體檢測豚鼠ASMCs。 [Ca~(2+)]i的測定：Fluo-3／AM的準備：細胞內(nèi)鈣熒光指示劑采用Fluo-3／AM1：200體積比將1mMFluo-3／AM用D-Hanks稀釋為終濃度5×10 ~(-6)mol·L~(-1)，加入貼壁培養(yǎng)ASMCs的培養(yǎng)皿中負載。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中避光孵育30～60min，而后用PBS沖洗2次后，穩(wěn)定15min，用倒置熒光顯微鏡及高靈敏度冷CCD數(shù)碼攝像機采集細胞熒光圖象，激發(fā)光波長488nm，發(fā)射光波長為528nm。應用Metafluo4.5分析軟件進行圖像處理時，對單個細胞進行圖像分析。鈣離子濃度的變化用AF／F_0的比值來表示，F(xiàn)_0為基礎熒光密度值，F(xiàn)為給予不同工具藥后細胞的熒光密度值，ΔF／F_0=(F-F_0)／F_0代表給藥后鈣離子的變化程度。 豚鼠腦、骨骼肌和心肌的取材：豚鼠擊頭處死，無菌條件下迅速取骨骼肌、心肌和小腦組織分別作為RyR1、RyR2和RyR3的陽性對照，取出后的組織部分放入2 ml無菌Eppendof管中，向管內(nèi)加入1 ml Trizol，用勻漿器充分勻漿后進行RNA提取。余下部分凍存于-70℃冰箱。 豚鼠ASMCs中ayRs各亞型的mRNA表達：Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計測RNA的純度及濃度，然后進行cDNA的合成。引物序列是根據(jù)小鼠和大鼠的ayR1，RyR2和RyR3的cDNA設計的。 各引物序列為 RyR1：上游引物5’-GAAGGTTCTGGACAAACACGGG-3’，下游引物5’-TCGCTCTTGTTGTAGAATTTGCGG-3’，，擴增產(chǎn)物435 bp； ayR2：上游引物5’-GAATCAGTGAGTTACTGGGCATGG-3’，下游引物5’-CTGGTCTCTGAGTTCTCCAAAAGC-3’，擴增產(chǎn)物635 bp； RyR3：上游引物5’-CCTTCGCTATCAACTTCATCCTGC-3’，下游引物5’-TCTTCTACTGGGCTAAAGTCAAGG-3’，擴增產(chǎn)物505 bp。 β-actin：上游引物5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’，下游引物5’-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3’，擴增產(chǎn)物300 bp。 引物由TaKaRa公司合成。以β-actin為內(nèi)參。反轉錄體系為：總RNA1μg，參照試劑盒的說明加入其它試劑，最后為10μl體系。反轉錄后進行PCR反應。PCR反應體系：5×PCR緩沖液10μl，Taq酶0.25μl，上游和下游引物各為1μl，加無菌水補足體積50μl。反應條件：94℃預變性2 min，以94℃30 s，58℃30s，72℃2 min的順序，共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，凝膠成像分析系統(tǒng)進行拍照、分析。 統(tǒng)計學處理：采用SPSS 11.5，用兩個獨立樣本的t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，顯著性標準為P＜0.05，P＜0.01。全部數(shù)據(jù)均表示為(?)±s。 實驗結果 1、在ASMCs外無鈣情況下，不同濃度ryanodine(5×10~(-5)mol·L~(-1)，10~(-4)mol·L~(-1)，2×10~(-4)mol·L~(-1))作用于原代培養(yǎng)正常與哮喘豚鼠ASMCs，[Ca~(2+)]i迅速升高，哮喘組明顯高于正常組(P＜0.01)。10~(-4)mol·L~(-1)的組織胺(histamine)作用于原代培養(yǎng)的正常組與哮喘組ASMCs，[Ca~(2+)]i升高無明顯差異(P＞0.05)。 2、傳代培養(yǎng)哮喘豚鼠ASMCs在10~(-4)、2×10~(-4) mol·L~(-1) ryanodine作用下，[Ca~(2+)]i迅速升高，與原代細胞比較，無明顯差異(P＞0.05)。在濃度為5×10~(-5)mol·L~(-1)時，原代明顯高于傳代(P＜0.01)。 3、在正常豚鼠ASMCs中，RyR1和RyR2兩種RyR亞型mRNA表達，且以RyR2的表達為主，未見RyR3的表達。 4、在哮喘豚鼠ASMCs中，也只有RyR1和RyR2兩種亞型表達，同樣，以RyR2的表達為主，但哮喘時，RyR1的表達明顯上調(diào)(P＜0.01)。 討論 哮喘是一種以氣道炎癥，氣道高反應性和氣道重構為特征的慢性疾病。近年來，多數(shù)學者認為氣道炎癥是哮喘的中心性特征，隨之導致氣道高反應性和氣道重構，而哮喘的臨床特征主要為氣道高反應性，氣道高反應性可能與炎癥、氣道平滑肌、神經(jīng)、遺傳等多種因素有關，有文獻報道氣道炎癥是哮喘患者氣道高反應性的重要原因，但在無氣道炎癥時，仍可發(fā)生非特異性的氣道高反應，如運動、冷空氣誘導的哮喘，因此推斷，氣道高反應性可能與ASMCs收縮特性改變相關，其收縮性增強已經(jīng)被廣泛懷疑是哮喘發(fā)生氣道高反應的重要原因。細胞內(nèi)鈣離子濃度是ASMCs維持其收縮特性的重要因素，鈣離子濃度升高支氣管平滑肌收縮增強，同時細胞內(nèi)鈣離子濃度升高也是支氣管平滑肌敏感性升高的主要原因。細胞內(nèi)鈣離子濃度增高也促進氣道平滑肌增生肥厚，導致氣道狹窄可進一步加重氣道高反應性。所以，哮喘與細胞內(nèi)鈣離子濃度升高存在重要的相關性。 本實驗主要就ASMCs內(nèi)鈣釋放通道進行研究。采用分離培養(yǎng)的方法，原代培養(yǎng)了正常豚鼠和哮喘豚鼠的ASMCs，對細胞內(nèi)鈣離子濃度進行測定，推測ASMCs內(nèi)鈣釋放通道的改變。本研究示豚鼠ASMCs對ryanodine具有反應性，哮喘時反應性更高，說明豚鼠ASMCs上存在RyRs，且與哮喘存在一定的關系。哮喘組SR上RyRs功能亢進，或因其敏感性升高，或RyRs水平上調(diào)，其機制需進一步研究。 同時，本研究明確了正常與哮喘豚鼠ASMCs中只有RyR1和RyR2的表達，RyR3沒有表達。并且，發(fā)現(xiàn)豚鼠ASMCs以表達RyR2為主。然而，哮喘時，RyR1的表達水平顯著上調(diào)，RyR2沒有明顯的改變。我們的研究發(fā)現(xiàn)哮喘時細胞內(nèi)鈣離子濃度升高是由RyR的功能亢進引起，那么，這種功能亢進被進一步證實了主要是由于RyR1的表達水平上調(diào)所致。RyR1的變化可能導致細胞內(nèi)鈣釋放的過程發(fā)生改變，最終使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，引起哮喘癥狀。這就證明了豚鼠ASMCs中RyRs與哮喘的發(fā)生存在密切相關性的觀點。RyR1的上調(diào)可能是引起哮喘的發(fā)病機制之一。 結論 1、哮喘豚鼠ASMCsryanodine受體內(nèi)鈣釋放功能升高。 2、特定條件下，哮喘傳代細胞仍然保持原代細胞內(nèi)鈣釋放通道的特性。 3、豚鼠ASMCs中只有RyR1和RyR2兩種亞型表達。 4、哮喘豚鼠ASMCs中也只有RyR1和RyR2兩種亞型表達。且哮喘時RyR1表達上調(diào)，提示細胞內(nèi)鈣釋放通道RyR1與哮喘疾病存在重要相關性。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R562.25

【參考文獻】

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1 周衛(wèi)芳,鄧海貞,季偉;扎魯司特對哮喘豚鼠氣道平滑肌厚度的影響[J];蘇州大學學報(醫(yī)學版);2003年06期

2 張媛莉,何建猷,梁標,宋澤慶;雷公藤甲素對哮喘大鼠氣道平滑肌增生及c-fos與c-jun表達的影響[J];中華結核和呼吸雜志;2002年05期

本文編號：2632763